裂殖壶菌产奇数碳脂肪酸的发酵调控与蛋白质组学研究

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奇数碳脂肪酸(Odd-carbon fatty acids,OCFA)是指碳原子个数为奇数的一类脂肪酸,在抗炎、治疗心血管疾病及癌症方面具有积极作用,被广泛应用于食品、制药和化工等领域。裂殖壶菌是一种异养海洋微藻,具有培养条件简易、生长速度快、生物产量高、油脂含量高和安全性能好等特点,是我国批准的藻油生产菌株,具有广泛的工业化应用前景。但是在现有的发酵技术条件下裂殖壶菌中OCFA产率较低,在脂质中含量一般不高于10%,难以满足工业需求。本文系统研究了培养基成分、发酵条件对裂殖壶菌产OCFA的调控规律,建立了生产OCFA的高密度发酵工艺,并利用蛋白质组学分析技术阐明了关键因素影响裂殖壶菌合成OCFA的分子机制。具体研究内容与结果如下:1.通过考察培养基成分、浓度对裂殖壶菌生长和OCFA含量的影响规律,确定了最适的培养基成分组合。在培养基中总碳比10:1,有机氮与无机氮比例8:1,葡萄糖浓度80 g/L,谷氨酸钠30 g/L,硫酸铵浓度1.2 g/L;添加5%(v/v)异丙醇可有效提升总脂肪酸中OCFA比例和产量,由起始的9.5%提高至18.8%,增幅为97.89%。2.探究裂殖壶菌发酵产OCFA关键影响因素,建立高密度发酵工艺并验证在小试生产中的稳定性。利用5L发酵罐进行放大培养并系统考察溶氧、pH、温度等环境因素对裂殖壶菌发酵产OCFA影响,发现温度是调控OCFA产率的关键因素。相比于33℃和28℃,在23℃时OCFA最高占比分别提高了64.51%和110.8%。在最适pH和溶氧条件下通过分批补料,OCFA含量和油脂产率最高分别达到32.19%和7.48 g/L;利用5 L小试生产装置进行6个批次的工艺验证,油脂含量和OCFA占总脂肪酸比例分别在28.0%-32.0%和27.0%-32.0%之间,表明该裂殖壶菌OCFA发酵工艺较为稳定,有较好的产业转化价值。3.通过串联质谱标签(Tandem Mass Tags,TMT)蛋白质组学进行差异蛋白功能和代谢通路分析,探究温度调控裂殖壶菌高产OCFA的分子机制。23℃培养与对照组(33℃)相比,菌体细胞内的糖酵解途径(EMP)和三羧酸循环(TCA)显著加强,提供了大量琥珀酰-CoA和丙酰-CoA,同时支链氨基酸代谢产生的丙酰-CoA也显著提高;并且FAS合成酶、乙酰CoA羧化酶、脂酰-CoA延长酶等表达量显著提高,促使丙酰-CoA进入OCFA合成途径,从而大幅提高裂殖壶菌OCFA的产率。本文通过研究培养基成分、高密度发酵条件对裂殖壶菌生长速度、油脂产量、脂肪酸组成的影响,使油脂产量由8.64 g/L提高到28.95 g/L,OCFA占总脂肪酸比例由9.5%提高到32%以上;利用蛋白质组学分析技术,解释了裂殖壶菌中OCFA的可能代谢通路。本文将有助于阐明裂殖壶菌脂肪酸合成代谢通路的调控机制,为裂殖壶菌的基因工程改造提供理论依据;有助于拓展裂殖壶菌的应用领域,推动微藻来源OCFA的产业化。
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