论文部分内容阅读
[目的]从整体、细胞及分子水平研究炎性因子在糖尿病大鼠周围神经修复再生中的作用及中药筋脉通是否能够通过干预炎性因子途径减轻神经组织损伤、促进神经再生修复,从而减少DPN的发生。[方法]1.动物实验将雄性SD大鼠随机分为正常(Con)组和造模组,造模组采用链脲佐菌素(60mg/kg)一次性腹腔注射建立糖尿病大鼠模型。造模成功后随机分为糖尿病(DM)组、筋脉通(JMT)组、神经妥乐平(Ntp)组,每组各10只。成模后予灌胃给药,JMT和Ntp组分别按成人剂量15倍给药,Con组和DM组则给予等量蒸馏水灌胃。连续灌胃16周,测量大鼠机械痛阈值,采用免疫组化、ELISA、Western Blot等方法观察DPN大鼠坐骨神经组织中IL-1β、IL-6、IL-10和]TNF-α等炎性因子及NGF、NT-3等神经营养因子的表达以及中药筋脉通的干预作用。2.细胞实验采用组织贴块法体外培养乳鼠坐骨神经雪旺细胞(SCs),设置正常对照组(25mmol/L葡萄糖)及50、75、100mmol/L不同浓度葡萄糖的条件培养基,采用CCK-8法摸索高糖对SCs的最佳作用时间和最宜作用浓度：分别加入普通培养基、正常鼠血清培养基、高糖培养基(Glu)、筋脉通(JMT)和神经妥乐平(Ntp)含药血清进行培养,探索筋脉通含药血清对高糖条件下SCs活性的影响；ELISA法检测不同干预条件下SCs上清液中IL-6、TNF-α、NGF的含量；Western Blot法检测SCs中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α及NGF、NT-3蛋白的表达。[结果]第一部分：1.血糖和体重：与Con组相比,各造模组大鼠血糖均升高(P<0.05)。药物干预后,治疗组血糖在同一时间点与DM组相比无统计学差异(P>0.05),治疗组间血糖在各时间点均无统计学差异(P>0.05)。造模后各组大鼠体重无统计学差异(P>0.05)。给药4周后,DM组与Con组相比体重下降(P<0.05)：给药8、12、16周各造模组与Con组相比体重下降(P<0.05),各造模组组间无统计学差异(P>0.05)。2.机械痛阈值：与Con组相比,DM组的左右足机械痛阈值均降低(P<0.05),糖尿病周围神经病变(DPN)模型成功建立。3. ELISA法检测DPN大鼠血清中IL-6、TNF-α、NGF的含量：(1) IL-6、TNF-α:与Con组相比,各组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均升高(P<0.05)；与DM组相比,JMT组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.05),Ntp组无统计学差异(p>0.05)：与Ntp组相比,JMT组IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.05)。(2)NGF：与Con组相比,DM组、JMT组大鼠血清中NGF含量减少(P<0.01、P<0.05)；与DM组相比,各治疗组均升高,差异具有显著性意义(P<0.01); JMT组较Ntp组血清中NGF含量减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.免疫组化法检测DPN大鼠坐骨神经中NT-3的表达：与Con组相比,DM组大鼠坐骨神经NT-3的IOD值下降(P<0.05)；与DM组相比,JMT组、Ntp组大鼠坐骨神经NT-3的IOD值升高(P<0.05); JMT组与Ntp组相比无统计学差异(P>0.05)。5. Western Blot检测坐骨神经IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、 NGF、NT-3蛋白的表达：(1) IL-1β、IL-10:与Con组相比,DM组IL-1β、IL-10蛋白表达增加(P<0.05)：与DM组相比,JMT组IL-1β、IL-10蛋白表达减少(P<0.05);JMT组与Ntp组相比无统计学差异(P>0.05)。(2)IL-6：各组IL-6蛋白表达均无统计学差异(P>0.05)；(3) TNF-α:与Con组相比,DM组TNF-α蛋白表达增加(P<0.05)；与DM组相比,JMT组、Ntp组TNF-α蛋白表达减少(P<0.05); JMT组与Ntp组TNF-a蛋白表达无统计学差异(P>0.05)(4)NGF：与Con组相比,DM组NGF蛋白表达减少(P<0.05)；与DM组相比,JMT组NGF蛋白表达增加(P<0.05)；与Ntp组相比,JMT组NGF蛋白表达增加(P<0.05)。(5)NT-3：与Con组相比,DM组NT-3蛋白表达减少(P<0.05)；与DM组相比,JMT组NT-3蛋白表达增加(P<0.05); JMT组与Ntp组无统计学差异(P>0.05)。第二部分：1.成功培养乳鼠坐骨神经SCs,经鉴定纯度可达90%以上。2.CCK-8比色法检测细胞活性：(1)糖浓度的选择：随培养时间的延长,各浓度葡萄糖组对SCs活性的抑制作用最早于48h时产生,50mM Glu组、75mM Glu组、100mM Glu组均表现出较为明显的抑制作用,故选择48h、50mMGlu作为最佳作用时间和最适糖浓度。(2)筋脉通含药血清对高糖条件下SCs活性的影响：与正常对照组相比,正常鼠血清组、JMT组的细胞相对活性均无统计学差异(P>0.05),50mM Glu组细胞相对活性下降(P<0.01),Ntp组细胞相对活性亦有所下降(P<0.05)：与50mMGlu组比较,JMT组细胞相对活性升高(P<0.01),Ntp组无统计学差异(P>0.05)；与Ntp组相比,JMT组细胞相对活性升高(P<0.01)。3.ELISA法检测SCs上清液中IL-6、TNF-α、NGF的含量：(1)IL-6：各组SCs上清液中IL-6含量均无统计学差异(P>0.05)；(2) TNF-α:与Con组相比,Glu组SCs.上清液中TNF-α含量增加(P<0.05)；与Glu组相比,JMT组SCs上清液中TNF-α含量降低(P<0.05)；与Ntp组相比,JMT组SCs上清液中TNF-α含量降低(P<0.05)。(3)NGF：与Con组相比,Glu组SCs上清液中NGF含量降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；与Glu组相比,JMT组与Ntp组SCs上清液中NGF含量均升高(P<0.05)。4.Western Blot检测IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、 NGF、 NT-3蛋白表达：(1)IL-1β：与Con组相比,Glu组IL-1β蛋白表达增加(P<0.05);与Glu组相比,JMT组IL-1β蛋白表达减少(P<0.01)；与Ntp组相比,JMT组IL-1β蛋白表达减少(P<0.05)(2)IL-6：各组IL-6蛋白表达无统计学差异(P>0.05)；(3)IL-10：与Con组相比,Glu组、Ntp组IL-10蛋白表达增加,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)；与Glu组相比,JMT组IL-10蛋白表达减少(P<0.01)；与Ntp组相比,JMT组IL-10蛋白表达减少(P<0.01)(4) TNF-α:与Con组相比,Glu组TNF-α蛋白表达增加(P<0.05)；与Glu组相比,JMT组TNF-α蛋白表达减少(P<0.05)；JMT组与Ntp组TNF-α蛋白表达无统计学差异(P>0.05)(5)NGF：与Con组相比,Glu组、Ntp组NGF蛋白表达降低(P<0.01)；与Glu组相比,JMT组NGF蛋白表达增加(P<0.05)；与Ntp组相比,JMT组NGF蛋白表达增加(P<0.05)(6)NT-3：与Con组相比,Glu组NT-3蛋白表达减少(P<0.05)：与Glu组相比,JMT组NT-3蛋白表达增加(P<0.05);JMT组与Ntp组NT-3蛋白表达无统计学差异(P>0.05)。[结论]1.动物实验(1)一次性腹腔注射STZ (60mg/kg)建立DM大鼠模型,16周测定DM大鼠机械痛阈值降低,DPN大鼠模型成功建立；(2)DPN大鼠坐骨神经组织中IL-1p、IL-10、TNF-α蛋白表达及血清中IL-6、TNF-α含量均明显增加,表明炎症反应和细胞因子参与了DPN的发生发展；(3)中药筋脉通能够降低DPN大鼠坐骨神经组织中IL-1β、IL-10、TNF-α蛋白表达及血清中IL-6、TNF-α含量,具有减轻炎症反应的作用；同时能够明显增加坐骨神经组织中NGF、NT-3表达。其中在改善血清中IL-6、TNF-α分泌和增加坐骨神经中NGF蛋白表达方面,作用优于Ntp组。(4)筋脉通具有改善DPN大鼠周围神经组织损伤的作用,干预炎症反应及促进神经营养因子分泌可能是其发挥作用的重要途径之一。2.细胞实验(1)采用组织贴块法原代培养SD乳鼠坐骨神经SCs,纯化后经S-100蛋白免疫组化鉴定,纯度可达90%以上。(2)高糖(50mmol/L)培养雪旺细胞48h时,对其活性具有明显抑制作用。JMT含药血清可显著提高高糖条件下SCs的活性,作用优于Ntp组。(3)高糖培养条件下SCs上清液中TNF-α含量及SCs中IL-1β、IL-10、 TNF-α蛋白表达均有所增加,提示高糖刺激了SCs产生炎症反应和炎症因子；(4)中药筋脉通能够降低SCs上清液中TNF-α含量及SCs中IL-1β、 IL-10、TNF-α蛋白表达；同时能够明显增加SCs中NGF、NT-3表达。其中在改善SCs上清液中TNF-α分泌、减少SCs中IL-1p及IL-10蛋白表达和增加SCs中NGF蛋白表达方面,优于Ntp组。[创新点]目前,炎症因子在糖尿病周围神经病变中所发挥的具体作用尚不甚明了,本研究拟从整体、细胞及分子生物学水平研究炎性因子对周围神经病变修复再生的作用及中药筋脉通是否能够通过影响炎性因子的途径减轻神经组织损伤,促进神经再生修复以减少DPN的发生,具有一定创新性。[目的] 研究中药筋脉通对于糖尿病(DM)大鼠背根神经节(DRG)氧化应激及细胞凋亡的影响。[方法]采用链脲佐菌素(STZ) 60mg/kg一次性腹腔内注射的方法制造DM大鼠模型,随机分为模型组,筋脉通小、中、大剂量组和维生素C组。所有实验大鼠灌胃16周处死,分离DRG,采用尼氏染色观察DRG形态学变化,免疫组织化学法和qRT-PCR法检测大鼠DRG中NADPH氧化酶p22-phox亚基、Cyt C、Bcl-2及Caspase-3的表达,TUNEL法检测细胞凋亡。[结果] 与模型组相比,各治疗组的NADPH氧化酶p22-phox亚基蛋白表达、Cyt C蛋白表达、Caspase-3 mRNA及其蛋白表达、细胞凋亡率均显著降低,而Bcl-2mRNA及其蛋白表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；且作用呈现一定的剂量相关性,其中,以筋脉通大剂量组作用最佳,与维生素C组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。[结论] 中药筋脉通可防治DPN大鼠周围神经组织损伤,抑制氧化应激、减少细胞凋亡是其作用的重要途径之一。大剂量筋脉通疗效最佳,其作用优于维生素C。