破伤风毒素是由破伤风梭菌在厌氧环境中产生的强烈的神经毒素,是已知最毒的毒素之一。根据破伤风毒素在体内的作用,将其分为A、B、C三个部分。破伤风毒素C片段（TetC）不具备神经毒性,却保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质,免疫效果与毒素相当,是毒素的保护性抗原,用TetC蛋白诱导产生的单克隆抗体（McAb）具有中和毒素的能力。TetC与神经元表面的结合是破伤风毒素其它片段发挥毒性作用的先决条件。本研究构建了原核表达TetC蛋白的重组大肠杆菌,获得具有抗原活性的融合蛋白,并制备了特异性针对TetC的McAbs,这为研究TetC的生物学功能、破伤风毒素结构与功能的关系提供重要条件,同时也为建立快速检测破伤风抗毒素水平的方法提供了生物材料。一、破伤风毒素C片段基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达根据破伤风梭菌64008菌株基因组DNA序列设计引物扩增TetC基因,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建出重组菌BL21（pGEX-6p-1-TetC）,经IPTG（1mM终浓度）诱导表达,利用Redipack GST purification module进行亲和层析获得纯化的表达产物。SDS-PAGE结果表明表达的融合蛋白GST-TetC大小与预期一致。Western-blot检测结果显示融合蛋白GST-TetC可以与破伤风类毒素抗血清发生特异性结合反应,说明其具有良好的免疫原性。二、破伤风毒素C片段单克隆抗体的制备及鉴定应用淋巴细胞杂交瘤技术,以重组菌Rosetta（DE3）（pET-TetC）表达产物His-TetC蛋白免疫8w雌性BALB/c小鼠,100μg/只。首免时,抗原与等量弗氏完全佐剂（FCA）乳化,皮下分点注射。间隔2w,用弗氏不完全佐剂（FIA）乳化抗原,腹腔注射进行第二次免疫。此后每隔2w用弗氏不完全佐剂乳化抗原腹腔注射一次,直至ELISA检测血清抗体效价达到1:10000以上,尾静脉注射等量的不加佐剂的抗原作为加强免疫。3d后,取免疫小鼠脾细胞和骨髓瘤Sp2/0-Ag-14细胞进行融合。以纯化蛋白GST-TetC作为检测抗原,用间接ELISA方法筛选阳性克隆,获得5株稳定分泌TetC单克隆抗体的细胞株,分别命名为1E5、5G10、6B9、7D6、7F5,亚类鉴定结果都为IgG₁,腹水测定效价除1E5为3×2¹⁰外,其余均为1×10⁵。Western-blot试验显示5株McAbs均能与融合蛋白His-TetC发生反应,出现特异性条带,而与作为对照的空载体细菌Rosetta（DE3）（pET）和BL21（6p-1）不发生反应,说明1E5、5G10、6B9、7D6、7F5这5株McAbs是特异性针对TetC表位的单抗。