非综合症型唇腭裂(nonsydromic cleft lip／palate，NSCL／P)的发病原因较为复杂，目前多倾向于遗传与环境因素的相互作用造成的。具有显著的遗传异质性，是一类极具挑战性和研究价值的遗传病。国外学者以动物实验和大样本人群为研究基础，应用连锁分析和关联分析的方法，自80年代后期以来，陆续报道了10—20个与NSCL／P有关的候选易感基因和位点，如1q32(IRF6)，2p13(TGFA)，4p16(MSX1)，6p23-25，14q24(TGFB3)，17q21(RARA)，和19q13(BCL3，TGFB1)等位点和基因得到了较多的研究。但是所得结果各不相同，甚至是相反。这就反应了在同一人群和不同种族之间遗传的异质性。然而，IRF6和MSX1这两个基因的研究在西方患者的研究中得到了较一致的结果，显示出了特殊的价值。IRF6基因是迄今发现的最有价值的与NSCL／P致病有关的基因之一。IRF6是通过研究Van der Woude’s综合症(VWS)——种孟德尔遗传缺陷，常染色体显性遗传疾病得来的。VWS患者的表型与单纯唇裂或腭裂存在部分重叠，同时85％综合症患者都存在下唇小凹陷。而15％的VWS患者临床表现与单纯唇裂或腭裂难以区分。VWS综合症的致病基因的研究，为NSCL／P致病基因的探索提供了有利的线索。最近，Zucchero等对IRF6基因内部及其邻近部位的36个SNPs位点进行研究，结果显示NSCL／P发生的12％的遗传因素归因IRF6基因V274I位点的变异。在随后的几个不同的种族的研究中又进一步证实了IRF6基因在NSCL／P的发生中是一个非常有意义的因子，发挥着一定的作用。MSX1作为核转录因子，可与TATAbox结合与其他因子共同组成核转录复合物，是器官发育过程中的主调控基因。目前为止，只有MSX1基因，不仅在小鼠胚胎头面部发育时期有表达，敲除该基因后，小鼠出现腭裂。Beaty等证实了MSX1CA等位基因与唇腭裂和单纯腭裂关联分析有统计学意义。Fallin等鉴别了位于MSX1基因上的8个SNPs，发现SNP7和SNP8在单位点关联分析中有统计学意义。Jezewski等证实MSX1基因的突变对越南人群中的NSCL／P的发生有着2％的贡献率。越来越多的研究显示NSCL／P是一种多基因易感性疾病，其发生与环境、遗传及其交互作用有关。流行病学调查和动物实验已证实孕早期吸烟、饮酒、药物、营养缺乏、病毒感染、高热等能显著增加唇腭裂畸形的发病风险。Maestri等分层分析表明NSCL／P与母亲孕早期吸烟及易感性基因的交互作用有关；Van Rooij IA等证实母亲为MTHFR 677TT和1298CC基因型且孕期叶酸缺乏，其后代忠NSCL／P风险增高7倍。我国唇腭裂患者的发病因素及机制可能与西方国家患者不同。迄今为止，在中国人群中，有关NSCL／P的发病与IRF6和MSX1多态性的相关性还不清楚。随着分子遗传学的迅猛发展，对NSCL／P的基因研究已经取得了一定的进展，目前仍有新的易感基因被不断发现，但国内在这方面的研究还刚刚起步。由于唇腭裂病因的复杂性、遗传模式的不确定性、不同地区甚至不同表型NSCL／P的候选基因座差异性，使研究结果重复性差，出现较多分歧，有的甚至出现背离。这仍是一个亟待解决的问题。为了充分认识IRF6和MSX1基因在NSCL／P的发病中的作用和地位，不断完善和发展其在唇腭裂发病机制的研究，以及为唇腭裂的产前诊断和预防提供科学依据，为此，本研究选择目前国外研究结果较一致的2个基因IRF6和MSXI作为候选基因，研究在中国西部人群中IRF6，MSXI基因SNPs与NSCL／P相关性。根据环境与遗传共同作用的致病观点，用病例对照研究方法，研究环境暴露和IRF6、MSX1基因多态性与NSCL／P的关系。旨在探讨IRF6，MSXI基因突变和环境因素在中国西部人群NSCL／P发病中的可能作用，同时也为中国西部人群基因数据库积累资料。为临床基因诊断提供理论依据，以对有唇腭裂病人的家庭提供有效遗传咨询，最终达到降低唇腭裂发生率的目的。本文以中国西部人群为研究对象，所有NSCL／P病例均选自四川大学华西口腔医院唇腭裂外科病房2005年4月至2006年10月期间的住院患者，共收集患者332名，患儿母亲289例，患儿父亲243例，完整三人核心家系(患儿+双亲)206个。174例对照样本选自同期的四川大学第二附属医院出生中心的新生儿脐带血。采集外周静脉血，提取基因组DNA。分别选择了IRF6和MSX1候选基因的各3个杂合度高的具有代表性的SNP位点(IRF6基因rs2013162，rs2235375和rs2235371(V274I)三个SNPs位点，MSXI基因Q147I，rs3821949和rs12532三个位点)，采用聚合酶链反应一限制性酶切片段长度多态(PCR-RFLP)的方法和直接测序的方法对这些多态位点进行基因型检测。应用病例-对照研究(Case-Control Comparisons)和传递不平衡检验(Transmission-Disequilibrium Testing，TDT)两种分析方法，分别进行了单个SNP位点及多个SNPs位点(单倍型)与NSCL／P之间的相关性的分析。对相邻SNP位点进行配对连锁不平衡检验(Linkage disequilibrium calculation LD)以检验相邻位点等位基因的非随机关系。应用病例—对照设计，对环境暴露因素和IRF6、MSX1基因多态性与NSCL／P的发生进行了多因素相关性研究，首先进行单因素x~2分析，筛选出“显著”因素，然后再对这些“显著”因素进行多因素Logistic回归分析。在中国西部人群中，IRF6基因rs2235371(V274I)多态性突变的G等位基因存在强的过渡传递。与正常对照组比较，在CL、CLP和总的CL／P组，rs2235371位点SNP的GG基因型和G等位基因的频率存在显著性差异(p=0.000)，患者的父亲和母亲组与正常对照组比较GG基因型频率和G等位基因的频率无显著性差异(p＜0.05)；TDT单点分析在CL、CLP和总的CL／P组，G等位基因的频率(95％CI≠1)存在显著性差异；而在CP分组中不存在显著性差异(p=0.472，OR=1.295，95％CI=0.639-8.685)。提示G等位基因可能与NSCL／P的发生相关联。但是在CP组：GG基因型频率(36.0％vs．29.8％，p=0.408)和G等位基因的频率(57.0％vs．50.5％p=0.149)无显著性差异。IRF6基因rs2235375位点，多态性突变的G等位基因存在强的过渡传递。与正常对照组比较，在CLP和总的CL／P组，rs2235375位点SNP的GG基因型和G等位基因的频率都存在显著性差异(p＜0.05)；患者的母亲组与正常对照组比较G等位基因的频率也存在显著性差异(p=0.001)；但是在CP组：GG基因型频率和G等位基因的频率均无显著性差异；TDT单点分析，在rs2235375位点总的CL／P组，G等位基因的频率(p＜0.05)存在显著性差异；而在其它分层分组中不存在显著性差异(p＞0.05)。提示rs2235375与中国西部NSCL／P的发生存在显著关联性。但是另外一个点rs2013162，病例—对照和TDT分析都没有发现与NSCL／P有相关性存在(p=0.840781)，这与先前的在欧洲人群中的结果非常不一致。导致不同的结果并不奇怪，因为这是在两个不同的群体中的遗传学研究。在本研究中我们通过Fbat分析发现了IRF6的这三个SNP位点所构成的多种单倍型中有5种是有统计学意义的。然而，有趣的是，在所有显示具有统计学意义的单倍型中都携带有rs2013162位点的G等位基因，其中最有意义的单倍型也是携带有rs2013162位点的G等位基因的G-G-G单倍型(P=0.000525)。这就意味着在我们所研究的人群样本中，尽管rs2013162位点本身的检验没有发现与NSCL／P的发病有关联性，但是在rs2013162位点附近以及与该位点GG等位基因所构成的单倍型与NSCL／P有强的关联性。IRF6基因的相邻两个SNP位点进行配对连锁不平衡检验，显示均存在不平衡传递(传递不平衡系数0＜D’＜1)。其中SNPs位点rs2235375和rs2013162之间存在中等程度的连锁不平衡关系(P=0.045)。MSX1基因研究结果显示rs3821949位点和rs12532位点与正常对照组比较，在CL、CP、CLP和总的NSCL／P组，以及患者的双亲组的3种基因型和2种等位基因的频率均无显著性差异(p＞0.05)；MSX1 P147Q位点无论是在正常对照组、在CL、CP、CLP和总的CL／P组，还是在患者的父母亲组P147Q位点SNP的GG基因型和G等位基因的频率都占到96.6％—100％，均未发现突变的TT基因型；T等位基因只占到1.0％—1.5％。TDT单点和多点的单倍型检验结果，MSX1 rs3821949和rs12532位点在本研究的人群中不存在传递不平衡。在各种模式下的Fbat(Family Based AssociationTest)检验，无论是2点还是3点间的各种单倍型组合，均未得出有统计学意义存在的单倍型。提示在本研究的人群中这3个SNP位点所构成的所有单倍型无传递不平衡存在。LD(Linkage disequilibrium)检验得出相邻两个位点间发生重组的几率非常大，共分离(传递失衡)很少发生。对环境暴露因素和IRF6、MSX1基因多态性与NSCL／P的相关性研究最后得出母亲孕早期患病史、母亲流产史、母亲孕早期服药史、父亲吸烟史和母亲孕期维生素补充史以及IRF6基因rs2235371位点GG基因型进入回归方程，是NSCL／P发病的影响因素，其中母亲孕期维生素补充史呈负相关性，起到保护性的作用，其余环境因素和IRF6基因rs2235371位点GG基因型都是NSCL／P发生的显著性危险因素。初步探索、证实了在中国西部人群中，NSCL／P是由环境与遗传共同作用致病的，必须重视加强对环境暴露的控制和利用。综上所述，在中国西部人群中，首次明确证实，IRF6基因在NSCL／P的发病中起着重要的作用，rs2235375和rs2235371(V274I)两个SNP位点的突变与NSCL／P的发病有着强的关联性。IRF6 rs2013162位点G等位基因参与构成的5种单倍型组合显示传递失衡，与NSCL／P的发病有着强的关联性。不能证实MSX1基因的这3个SNP位点与NSCL／P有相关性，提示在本研究的人群中这3个SNP位点所构成的所有单倍型无传递失衡。LD(Linkage disequilibrium)检验得出相邻两个位点间发生重组的几率非常大，共分离(传递失衡)很少发生。初步探索、证实了在中国西部人群中，母亲孕早期患病史、母亲流产史、母亲孕早期服药史、父亲吸烟史和母亲孕期维生素补充史以及IRF6基因rs2235371位点GG基因型是NSCL／P发生的显著性影响因素，NSCL／P是由环境与遗传共同作用致病的。