【摘 要】
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目的:诱导hiPSCs分化为hiPSC-CMs,观察细胞线粒体结构及功能的变化,评估AMPK与hiPSCs分化成熟的关联。探讨AMPK调节线粒体功能对hiPSC-CMs成熟的影响及其可能的机制。方法:（1）使用PGM1培养基复苏培养hiPSCs,通过显微镜观察hiPSCs生长状态,免疫荧光检测hiPSCs的多能性。（2）通过时序性调控Wnt信号通路的方法诱导hiPSCs为hiPSC-CMs,免疫荧
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目的:诱导hiPSCs分化为hiPSC-CMs,观察细胞线粒体结构及功能的变化,评估AMPK与hiPSCs分化成熟的关联。探讨AMPK调节线粒体功能对hiPSC-CMs成熟的影响及其可能的机制。方法:（1）使用PGM1培养基复苏培养hiPSCs,通过显微镜观察hiPSCs生长状态,免疫荧光检测hiPSCs的多能性。（2）通过时序性调控Wnt信号通路的方法诱导hiPSCs为hiPSC-CMs,免疫荧光染色和流式细胞术检测hiPSC-CMs的心肌特异性标志物的表达。（3）将诱导分化的hiPSC-CMs在特定时间进行处理,进行如下实验分组:对照组;AMPK抑制组（Compound C）;AMPK激活组（AICAR）;AMPK激活协同PDK4抑制组（AICAR+DCA）。（4）Western blot和q RT-PCR检测AMPK、能量代谢相关因子、心肌标志因子、电生理相关基因的表达情况;免疫荧光观察hiPSC-CMs细胞形态与肌节结构;己糖激酶活性试剂盒与乳酸含量检测试剂盒评估hiPSC-CMs的己糖激酶活性与乳酸含量;通过Fluo-4评估hiPSC-CMs钙瞬变功能。（5）通过透射电镜与Mito Tracker染色观察细胞线粒体超微结构及线粒体形态的变化;使用JC-1染色评估线粒体膜电位的变化;ATP检测试剂盒检测细胞内ATP含量;通过线粒体压力测试和底物氧化应激评估OCR和脂肪酸氧化（FAO）;检测线粒体融合、分裂蛋白的表达情况,q RT-PCR检测线粒体DNA拷贝数。结果:（1）hiPSCs呈具有紧密排列和清晰边界的集落样生长;免疫荧光结果显示hiPSCs表达多能性标志物Nanog和Sox2。（2）hiPSC-CMs在分化8天后开始自发收缩,在分化第12天左右细胞强烈搏动。流式分析结果表明,诱导分化后的细胞含有92%以上c Tn T阳性细胞,且免疫荧光染色显示hiPSC-CMs表达心肌特异性标记物α-actinin、Cx43和c Tn T。此外,免疫荧光染色显示hiPSC-CMs表达CMs心室肌特异性标志物MLC2v与心房肌特异性标志物MLC2a。（3）透射电镜与Mito Tracker染色结果显示hiPSCs细胞中线粒体呈颗粒状,嵴稀疏;hiPSC-CMs的线粒体存在一些更成熟、更细长、呈网络状连接的线粒体,线粒体内嵴更密集,基质更致密;hiPSC-CMs在基础呼吸、ATP产生和最大呼吸相关的OCR值以及线粒体膜电位显著高于hiPSCs。（4）Compound-C抑制AMPK降低hiPSC-CMs基础呼吸、最大呼吸和ATP产生的OCR值,抑制CMs标志基因的表达,降低线粒体DNA拷贝数,提示AMPK与hiPSC-CMs成熟相关（5）激活AMPK促进hiPSC-CMs能量代谢相关因子的表达,降低己糖激酶活性与乳酸的产生;激活AMPK的hiPSC-CMs具有更长的肌节,“圆度指数”降低;激活AMPK的hiPSC-CMs促进了心肌相关基因及电生理相关基因的表达;激活AMPK改善hiPSC-CMs钙瞬变动力学。（6）透射电镜观察到AICAR处理的hiPSC-CMs中线粒体的数量增加且含更多的线粒体嵴;此外,肌原纤维丰富且排列整齐,可见肌纤维的Z线。Mito Tracker染色结果显示hiPSC-CMs含有带片段的分离线粒体,AICAR处理的hiPSC-CMs由广泛互连的丝状网络组成。（7）激活AMPK的hiPSC-CMs促进线粒体融合蛋白的表达,抑制线粒体分裂蛋白的表达,同时增加了线粒体DNA拷贝数;激活AMPK的hiPSC-CMs线粒体膜电位增强,增加与线粒体基础呼吸、最大呼吸、ATP产生的OCR值,促进脂肪酸氧化。（8）AMPK激活协同PDK4抑制促进代谢相关因子的表达,增加与线粒体基础呼吸、最大呼吸、ATP产生的OCR值。结论:hiPSC-CMs线粒体氧化代谢的增强与AMPK的活化有关,激活AMPK可通过调节线粒体功能促进hiPSC-CMs的成熟,且可能是通过调节PDK4的表达来实现的。
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