背景:功能性消化不良（functional dyspepsia,FD）是临床十分常见的功能性胃肠道（FGID）疾病之一,该疾病的临床症状常表现为长时间或反复间断性的上腹痛、腹胀、嗳气、恶心等,并排除可能引起上述症状的其他疾病,临床按罗马Ⅳ标准划分成二类,分别为上腹疼痛综合征（Epigastric Pain Syndrome,EPS）与餐后不适综合征（Postprandial Distress Syndrome,PDS）。因为FD的临床发病率高,但临床治疗效果并不理想,很多患者反复发作,对其生活和工作造成严重影响。有研究认为可能是与患者的胃肠动力障碍、内脏的高敏性、幽门螺旋杆菌感染及患者的社会心理压力过大等各方面的因素相关。十二指肠黏膜的免疫活化作用在FD的发病机制中发挥了重要的作用,有研究显示十二指肠肥大细胞、嗜酸性粒细胞的增生与FD有关。而十二指肠的肠胶质细胞（EGCs）在维持肠上皮屏障的完整性上发挥关键作用,由胶质细胞分泌的神经营养因子（GDNF）是肠道屏障功能一个新颖的调节器,有报道称GDNF与功能性消化不良症状相关,十二指肠肥大细胞、嗜酸性粒细胞的增生可能影响GDNF的分泌。Micro RNAs是一类小型非编码RNA,有研究表明Micro RNAs参与FGID的发病机制调控,而且Micro RNAs的靶位点基因变异可能是影响人类FGID风险的重要遗传来源,在胃肠道有发现miR-383和miR-211的表达,但在FD中这两个miRNAs的功能尚不清楚,有待进一步研究。目的:此研究方案主要目的是在功能性消化不良发病过程中找到参与GDNF信号传导的潜在miRNA,并探讨此miRNA通过靶向作用于GDNF表达参与功能性消化不良发病的分子机制。因此,实验第一部分在临床上寻找与功能性消化不良发病机理相关的miRNA候选物,实验第二部分将在肠胶质细胞株中研究miR-211调控肠胶质细胞表达GDNF的作用,检测miR-211是否能够促进或者抑制GDNF的分泌,实验的第三部分将使用EGC-CM和IEC-6共培养模型,研究EGC-CM在小肠上皮细胞增殖和迁移中的作用,以及miR-211和GDNF对p38MAPK信号通路的影响,第四部分再次通过对FD患者十二指肠黏膜的检测来确定miR-211与GDNF、以及FD患者的相关性。方法:1、筛选2个与GDNF表达相关的miRNA,即miRNA-211和miRNA-383,6个功能性消化不良患者的十二指肠活检和6个正常人常规对照活检,每一位个体将取两个十二指肠活检标本。6个用10%福尔马林固定后石蜡包埋,切片厚度5μm,使用40倍显微镜统计嗜酸性粒细胞和肥大细胞,6个用于real time PCR检测miRNA和GDNF;2、培养肠神经胶质细胞,检测miRNA在GDNF的转录调节作用,EGCs将被转染miRNA抑制剂或miRNA的类似物,用real-time PCR检测miRNA和GDNF的表达,ELISA检测GDNF蛋白表达量;3、PCR筛选出最佳GDNF siRNA,分别用miR-211 inhibitor、miR-211 mimics、GDNF siRNA分组处理EGCs,用ELISA assay检测不同组别中GDNF的分泌水平,然后取分组处理后的EGCs的培养基与小肠上皮细胞共培养。并分组进行细胞划痕实验、细胞增殖实验研究EGC-CM在小肠上皮细胞增殖和迁移中的作用,用Western blot检测p38 MAPK信号通路是否受影响;4、最后再取20个功能性消化不良患者十二指肠活检和20个常规对照活检,每一位个体将取两个十二指肠活检标本,一个用10%福尔马林固定后石蜡包埋,切片厚度5μm,使用40倍显微镜统计嗜酸性粒细胞和肥大细胞,另一个用于qRT-PCR检测miRNA和GDNF;5、统计分析:统计描述使用x±s表示,使用F检验对方差齐性进行检验,不同组别间的差异性分析使用t检验及方差分析,所有统计分析均使用Graph Pad Prisin v6软件和SPSS19.0软件进行。以p<0.05为差异有统计学意义。结论:1、在功能性消化不良患者十二指肠黏膜中肥大细胞和嗜酸性粒细胞有高于正常人的趋势,肥大细胞差异更显着。在功能性消化不良患者组织中GDNF表达显着低于正常人,且相同组织中miR-211表达则有显着高于正常人,与假说相符,后期增加样本数进一步检测;2、EGC细胞转染实验的qRT-P CR检测结果表明miR-211抑制物对GDNF的表达具有上调作用。ELISA实验中在吸收光450nm波长处,miR-211模拟物GDNF的OD值下调作用很显著,miR-211抑制物的GDNF的OD值上调作用也较显著。此结果表明miR-211模拟物对GDNF的表达起抑制下调作用,而miR-211抑制物对GDNF表达有上调作用,此结果与qRT-PCR检测的结果相吻合;3、小肠上皮细胞株与EGC培养基共培养后,ELISA实验表明miR-211 mimics对GDNF的表达起抑制作用显著,F组合成的GDNF siRNA也起下调作用,miR-211 inhibitor对GDNF的表达则起到上调作用;4、细胞划痕处理细胞24h之后,对伤口的愈合面积进行了统计分析。结果表明在miR-211 mimics和GDNF siRNA两个实验组中,伤口愈合面积起下调作用,这表明了GDNF基因表达下调时,细胞的迁移受到了抑制作用;5、细胞增殖实验中,IEC-6细胞与分组设计的EGC-CM共培养24、48小时后,统计学表明,GDNF对IEC-6细胞增殖无明显影响。6、Western blot蛋白检测结果表明:miR-211 inhibitor组实验中p-38MAPK蛋白起下调作用,对磷酸化的p-38 MAPK蛋白下调作用更显著;在miR-211 mimics组中p-38 MAPK蛋白则起上调作用,磷酸化的p-38MAPK蛋白上调作用更显著。蛋白条带的表达结果与统计分析结果相一致（P-p38 MAPK、p38 MAPK、和内参β-Actin三个蛋白的WB检测各设置了3个重复）。此结果表明,GDNF的表达对p-38 MAPK通路有一定的影响;7、20例组织样本的qRT-PCR检测的结果表明:在FD组十二指肠组织中,GDNF的表达下调较显著,而miR-211的表达上调作用。此结果符合假说,即miR-211的上调作用可能抑制了GDNF的表达。20例组织样本的嗜酸性粒细胞、肥大细胞数目相对于健康对照组有所增加。