研究背景心肌梗死(MI)是严重危害人类健康的常见多发病之一,尽管目前应用于临床的许多治疗方法已经取得了很大的进展,但仍达不到令人满意的效果。以促进新生血管来增加缺血组织灌注的方法,成为治疗缺血性心脏疾病的新希望。内皮祖细胞(EPCs)作为内皮前体细胞,可增加血流和毛细血管密度,促进新生血管形成,对血管再通和修复起重要作用。当机体发生组织缺血或血管损伤时,EPCs从骨髓动员进入外周血,黏附募集到组织缺血或内皮损伤的部位而发挥作用。但机体自身靠EPCs对心肌血管的修复作用却是有限的,动员骨髓增加外周循环中EPCs的数量将成为治疗MI类相关疾病的有效策略。淫羊藿苷(Icariin)是传统中药淫羊藿的有效化学成分之一,可促进体外培养的人外周血EPCs增殖,对血管内皮细胞损伤和心肌损伤具有良好的保护作用。Icariin对EPCs具体的生物学功能影响不清,其是否通过EPCs促缺血心肌血管新生及具体机制并不明确。因此,研究Icariin增加和动员EPCs促心肌血管新生作用及机制,将为Icariin在MI类相关疾病的治疗及应用提供理论依据和实验参考。目的建立大鼠骨髓来源的EPCs培养模型,考察Icariin对体外培养的EPCs增殖、黏附、迁移和血管生成等功能的影响,以及Icariin作用于EPCs相关信号通路；研究Icariin对MI大鼠外周血及骨髓EPCs的作用,探讨Icariin对血管生成和EPCs动员的影响和可能机制。方法密度梯度离心法分离大鼠骨髓EPCs,应用免疫荧光鉴定内皮细胞系列标志VEGFR-2、CD34以及祖细胞标志CD133,并通过检测其对FITC标记的凝集素-1(UEA-1)的吸附和内吞DiI标记低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)来进行细胞生物学特性鉴定；观察体外培养条件Icariin对EPCs的生长情况；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EDU)法检测Icariin对EPCs增殖的影响；Transwell法检测EPCs的迁移能力；利用EPCs微管形成实验和鸡胚尿囊膜实验考察Icariin对血管生成的影响。通过结扎大鼠冠状动脉左前降支,建立大鼠MI模型,术后第二天将大鼠随机分为Icariin给药组及对照组,给药组连续给予Icariin28天后,腹主动脉取血测定心肌酶谱、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化型谷胱甘肽(GSSG).谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量；分离培养外周血及骨髓单个核细胞培养后,通过流式细胞仪计数EPCs,剖取心脏进行氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色测量梗死面积,并进行心脏组织的HE染色病理检查；取缺血区心肌免疫组化法测毛细血管及微管密度和EPCs分化情况。结果梯度密度离心法分离的单个核细胞,特异性表达抗原CD34.CD133和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR-2)。体外培养的大鼠EPCs生长增殖旺盛,14天以后细胞开始衰退。EPCs具有对DiI-ac-LDL摄取和UEA-1结合特性。MTT法检测Icariin对大鼠EPCs增殖能力显示,与对照组相比,Icariin各剂量组均能明显增加细胞活性,促进细胞增殖。Icariin 5μM、10μM剂量组与对照组比较,Edu标记4h细胞数明显增加；Edu标记24h,Icariin各剂量组与对照组比较,增殖的细胞数明显增多,细胞增殖率均在75～80%之间。细胞黏附试验显示,与对照组相比,Icariin10μM剂量组能增加EPCs的黏附；Icariin各剂量组与对照组相比,穿过Transwell小室膜的细胞数量明显增加,且穿膜的细胞数量随Icariin剂量的增加而增加,有明显的量效关系。经细胞划痕试验,Icariin各剂量组与对照组相比,细胞划痕间隙明显变窄。对EPCs微管形成能力考察显示,Icariin5μM、10μM剂量组能够促进体外培养的EPCs微管的形成。考察EPCs对鸡胚尿囊膜血管的能力显示,随着 Icariin剂量的增加,鸡胚尿囊膜微血管面积均增多。实时荧光定量PCR(Real time PCR)定量分析表明,Icariin5μM、10μM剂量组与对照组相比,趋化因子受体4(CXCR4) mRNA水平明显增加。而Icariin各剂量组与对照组相比,均能明显增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)mRNA、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)mRNA和内皮型一氧化氮合酶(eNOS) mRNA的表达水平,10μM Icariin剂量组的血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和SDF-1 mRNA的表达量升高,明显高于对照组。制作在体大鼠心梗模型,连续给予药物,心脏组织经HE染色病理学检查显示,对照组大鼠心肌出现明显陈旧性心梗,而Icariin各给药组心肌出现不同程度的心梗及炎症浸润。Icariin各给药组与模型组比较,梗死面积明显减少。Icariin能够降低心肌酶谱中的谷草转氨酶(GOT)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和α-羟丁酸脱氢酶(α-HBD)的水平,而对乳酸脱氢酶(LDH)、GSH、GSSG和SOD无影响；Icariin能够降低血清MDA的含量。Icariin各给药组能明显增加外周血中骨髓EPCs相对数量,对骨髓EPCs相对数量影响不显著。免疫组化染色心肌组织切片显示,Icariin各剂量组与模型组相比,CD133和第Ⅷ因子相关抗原(vWF)表达阳性细胞数增加；Icariin 5 mg/kg、10 mg/kg剂量组与模型组相比,心肌组织CD34阳性细胞表达量明显增加。结论1. Icariin可促进体外培养的EPCs增殖、黏附、迁移和血管生成等功能,其可能的机制与CXCR4/PI3K/Akt和VEGF/eNOS等细胞信号通路有关。2. Icariin能明显改善大鼠MI的状况,增加大鼠外周血EPCs数量,促进梗死心肌微管形成,这种血管新生有EPCs的参与。3. Icariin能改善MI,其作用机制为增加、动员大鼠骨髓中EPCs,促使循环中内皮祖细胞数量增多,梗死灶黏附、聚集,进而促进其分化成血管内皮细胞形成血管。