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新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)感染引起的禽类传染病,是一类动物疫病,严重危害养禽业的健康发展。核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)作为NDV的主要结构蛋白,是抗NDV抗体检测方法建立的主要靶抗原。纳米抗体相比于传统抗体具有分子量小,易于基因工程改造的优点。为了建立NDV新型诊断技术,本研究基于纳米抗体的优点,将其应用于NDV新型诊断技术的研发中。本研究首先利用原核表达系统表达NDV的NP蛋白,将NDV-NP可溶性重组蛋白免疫双峰驼,然后利用噬菌体展示技术,通过3轮淘选,共筛到9株针对NP蛋白的特异性纳米抗体。随后,基于针对NDV-NP蛋白的纳米抗体,建立了纳米抗体—辣根过氧化物酶(HRP)融合蛋白制备平台,然后将该融合蛋白用于开发鸡血清中抗NDV抗体的竞争性ELISA(cELISA)检测方法。1、NDV-NP重组蛋白的表达与纯化构建重组NDV-NP重组表达载体,Western blot和SDS-PAGE分析在56 kDa有预期大小的重组蛋白NDV-NP蛋白。2、抗NDV-NP蛋白纳米抗体库的构建以及特异性纳米抗体的筛选将NP蛋白免疫双峰驼。六次免疫后,检测血清中针对NP重组蛋白的特异性抗体效价达到1:256000。分离淋巴细胞,提取总RNA,再反转录为CDNA。经巢式PCR扩增出纳米抗体的重链可变区(VHH)基因;然后,通过酶切,连接和转化得到3×10~8pfu/mL大小的VHH噬菌体展示文库,基因测序鉴定文库的多样性良好。以NP重组蛋白作为特异性纳米抗体淘选的包被抗原,经过3轮淘选,最终筛选出9株针对NP重组蛋白的特异性纳米抗体。3、基于纳米抗体-HRP融合蛋白鸡血清中抗NDV抗体竞争ELISA检测方法的建立首先利用不同的基因原件,构建pEGFP-NDV-NP-Nb5真核表达载体,该重组质粒转染HEK293T细胞后,IFA和Western blot结果表明,NDV-Nb5-HRP成功在HEK293T细胞中分泌表达。随后,成功建立了鸡血清中抗新城疫抗体的竞争ELISA检测方法。