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肿瘤细胞发生多药耐药(Multidrug resistance，MDR)是临床上肿瘤治疗走向失败的主要原因之一。目前已发现多个基因参与耐药发生，其中多药耐药基因1(MDR1)几乎在所有耐药细胞中均存在异常表达。在前期的研究中，我们发现MDR1的mRNA-5’UTR(信使RNA的5’端非编码区)中存在内部核糖体进入序列(Internal Ribosomal Entry Sequence，IRES)。通过NCBI数据库中的序列搜索比对，发现前期研究中所检测的MDR1序列与最新报道的数据相比，其上游5’端缺失75bp。为了更准确地对MDR1的mRNA-5’UTR中IRES活性区域进行研究，我们一方面将5’端缺失75bp的序列进行补齐；另一方面将MDR1的mRNA-5’UTR进行分段截短，利用双顺反子表达载体pCI-EGFP-XDsRed(X：待检测是否具有IRES活性的序列)对其IRES中心活性域进行深入探究。EGFP及DsRed的表达主要采用倒置荧光显微镜、Western blot、荧光分光光度计及流式细胞仪等检测手段进行直观、定性及定量分析。结果显示：全长序列的MDR1的mRNA5’-UTR存在IRES活性，其IRES的中心活性域主要集中于5’-UTR的下游3’端的247bp序列，且活性低于脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)。MDR1的mRNA-5’UTR中IRES活性区的初步确定为后续MDR1在翻译水平上的调控研究提供了理论基础，并为肿瘤多药耐药机制的解析提供了新的思路。目前，常用的IRES活性检测手段为双顺反子表达载体。该质粒上游的报告基因可依赖帽子结构的经典翻译方式得以表达，下游的报告基因需通过IRES介导的翻译途径进行表达，转录后两个报告基因存在于同一条mRNA上。而在真核生物的正常生理条件下，mRNA多为单顺反子，该检测质粒并不能完全反映待检测序列处于正常生理环境中的IRES活性。为此，我们设计了双启动子双报告基因表达载体pCI-cmvEGFP-cmvXDsRed (X：待检测是否具IRES活性的序列)，以实现在一个载体上含两个启动子区，分别启动相应的荧光蛋白表达。由于启动子相同，所以各自转录的mRNA水平一致。此时，两种荧光蛋白的表达差异将直接反映插入序列对翻译的影响。通过改变外界条件可实现对IRES的诱导，两种荧光蛋白表达比值在诱导前后的差异将更为直观地体现插入序列的IRES活性。我们成功构建了含双启动子的表达载体pCI-cmvEGFP-cmvXDsRed (X：MDR1-5’UTR，EMCV)，该质粒中的两个报告基因可同时表达。双启动子双报告基因表达载体的成功构建为后续的检测IRES新方法的确立奠定了基础。