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灵芝是中国传统的药用真菌,它被用于治疗各类疾病已有几千年的历史。灵芝具有多种生物活性成分,如灵芝三萜、灵芝多糖和灵芝甾醇等。三萜类物质灵芝酸是灵芝主要的活性成分之一,现代医学研究表明,灵芝酸具有抗肿瘤、抗HIV病毒和免疫调节等作用。然而,灵芝酸较低的产量严重限制了它的临床前研究及商业应用,开发高效的灵芝酸生产策略具有重要的实际意义。一些真菌的无性产孢与次级代谢的积累紧密相关,如在构巢曲霉和黄曲霉中无性孢子的产生影响杂色曲霉素、海藻糖和黄曲霉毒素等次级代谢产物的生物合成。早期的研究发现在液体静置培养中灵芝细胞中的灵芝酸含量高于悬浮培养的细胞中含量,并且在灵芝细胞液体静置培养中也有无性孢子的产生。在灵芝中通过调控无性产孢开发高效的灵芝酸生产方法,未有相关的研究报道。在本研究中我们发现,通过单核化获得的一些菌株能显著提高灵芝液体静置中无性孢子的生产。在培养的第6、9和12天,单核菌株G.260125无性孢子量分别是2.49±0.55、2.55±0.21和3.14±0.59×10~7个/cm~2,是双核菌株CGMCC5。26无性孢子量的1.51、1.51和1.34倍,G.260125的最大生物量为11.07±0.47 g/L,CGMCC5.26的最大生物量为9.39±0.18 g/L。产孢相关基因gl25098的表达分析显示它在单核菌株中的表达量,在第6天和第9天分别为双核菌株的2.2和6.2倍。以上结果说明单核化菌株G.260125的无性孢子产量高于双核菌株CGMCC5.26。对这个菌株产灵芝酸的能力进行分析,发现单核菌株G.260125的GA-Mk,GA-T和GA-Me和总灵芝酸含量最大为78.32±6.93、358.97±33.33、12.75±1.06?g/100mg细胞干重和2.44±0.13 mg/100 mg细胞干重,分别是双核菌株的2.9、3.4、1.7和1.5倍。为了初步探讨相关的机制,我们分析了灵芝酸合成的中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的积累以及关键酶基因3-羟基-3-甲基戊二酰-乙酰辅酶A(hmgr),角鲨烯合成酶基因(sqs)和羊毛甾醇合成酶基因(ls)表达水平。单核菌株G.260125中羊毛甾醇和鲨烯的最大积累量分别是8.49±0.17和1.07±0.02?g/100 mg细胞干重,分别比CGMCC 5.26菌株中的积累量提高了2.4和1.8倍。在单核菌株G.260125中hmgr和ls的最高转录水平分别为对照菌株的2.7和1.5倍。灵芝酸高产可能与提高中间代谢产物鲨烯和羊毛甾醇的积累量以及关键酶基因hmgr和ls的表达上调有关。我们在其他三株灵芝菌株CGMCC5.542、5.616和5.249中应用了开发的策略。结果发现单核菌株G.5.249-500、G.5.542-305和G.5.616-1中无性孢子产量分别是对应双核菌株的1.54、2和1.51倍。在液体静置培养中,单核菌株G.5.249-500灵芝酸GA-Mk、GA-T和GA-Me与总灵芝酸含量分别比对应双核菌株提高了9.58、4.47、2.15和1.73倍,G.5.542-305和G.5.616-1的灵芝酸含量相较于对应的双核菌株也显著提高,上述结果说明开发的策略具有一定的普遍性。进一步我们将培养体系从50 m L放大到1L,并实施了开发的策略。灵芝单核菌株G.260125和双核菌株CGMCC 5.26的最大生物量分别为13.46±0.4和11.07±0.47 g/L。单核菌株和原始菌株的GA-Mk,GA-T和GA-Me和总灵芝酸最大产量分别是8.66±0.37、51.72±3.22、1.66±0.08 mg/L和353.32±18.15 mg/L,单核菌株分别是原始菌株的2.06、2.18、1.88和2.04倍。在这项研究中,我们开发了一种通过促进无性产孢提高灵芝酸生产的方法,并在四株灵芝菌株和模式菌放大培养中成功实施了该策略。发现灵芝酸的高产可能与鲨烯和羊毛甾醇的较高积累及合成基因hmgr和ls的上调有关。本研究为灵芝酸的高效生产提供了一种新的手段,并为深入了解灵芝无性产孢与灵芝酸代谢调控之间的关系提供了重要信息。