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帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是仅次于阿尔茨海默病的第二大中枢神经退行性疾病,其临床症状主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌僵直和姿势障碍等。流行病学研究显示,60岁以上的人群,PD的发病率超过1%,并且随着年龄的增长PD发病率也随之增加。预计到2030年,我国PD患者将增至500万,约占世界PD患者总数的50%以上。由于PD的病因、病理机制至今尚未完全阐明,目前仍然缺乏有效的治疗措施。PD的病理学特征主要表现为中脑黑质致密带多巴胺能神经元选择性缺失、残存的多巴胺能神经元内出现α-突触核蛋白聚集形成的路易小体。自噬是细胞降解自身受损细胞器和长寿命蛋白(如α-突触核蛋白)的主要途径。衰老、遗传和环境因素均可导致自噬功能障碍,从而不能有效地清除受损细胞器和毒性蛋白聚合物;而受损细胞器和毒性蛋白聚合物则会进一步损伤自噬功能,如此形成恶性循环,引起多巴胺能神经元退变。在PD患者和PD动物模型的大脑中均存在自噬功能障碍。PD相关的细胞和动物实验证明,自噬相关基因的过表达或小分子自噬诱导剂可有效清除α-突触核蛋白,保护多巴胺能神经元。因此寻找新型的小分子自噬诱导剂成为预防或治疗PD的一项有效策略。在前期研究中,我们首次从中草药钩藤中筛选出吲哚类哺乳动物雷帕霉素靶标(The mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂——柯诺辛,并且在PD细胞模型上证实柯诺辛可通过诱导自噬有效清除α-突触核蛋白,然而尚未在PD动物模型中评估柯诺辛的神经保护作用。在本研究中,我们拟在C57BL/6n雄性小鼠(10周龄)通过灌胃给予鱼藤酮构建PD小鼠模型,以临床药物美多芭作为治疗PD的阳性对照药物,以经典mTOR抑制剂——雷帕霉素作为自噬诱导剂的阳性对照药物,通过灌胃给予柯诺辛,并且评价柯诺辛的神经保护作用。首先,我们将C57BL/6n小鼠随机分为6组:空白溶剂对照组(对照组)、鱼藤酮诱导的PD小鼠模型组(Rotenone组,30mg/kg)、美多芭组(Rotenone+Madopar组,1.95mg/只)、雷帕霉素组(Rotenone+Rapamycin组,10mg/kg)、低剂量柯诺辛组(Rotenone+Cory-L组,5mg/kg)、高剂量柯诺辛组(Rotenone+Cory-H组,10mg/kg)。在实验周期的第五周末和第九周末通过爬杆实验和转棒实验检测小鼠的运动功能,运用高效液相法检测小鼠纹状体内的多巴胺含量变化,采用免疫组化检测小鼠黑质致密带酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞数量的变化,采用免疫荧光染色法检测小鼠黑质区小胶质细胞的激活情况。通过上述一系列实验,综合评估柯诺辛在鱼藤酮诱导的PD小鼠模型上的神经保护作用。具体实验结果如下:1.爬杆实验:在实验周期的第五周末,与对照组相比,鱼藤酮组小鼠的转头时间无显著性差异(F=3.082,P>0.05,n=13-18),但是鱼藤酮组小鼠爬杆时间明显增加(F=9.746,P<0.001,n=13-18)。与鱼藤酮组相比,美多芭组小鼠转头时间无显著性差异(P>0.05,n=13-16),但是爬杆时间明显缩短(P<0.05,n=13-16),其他三组(雷帕霉素组,低剂量和高剂量柯诺辛)的转头时间和爬杆时间均没有显著性差异(P>0.05,n=8-13)。与美多芭组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠转头时间和爬杆时间均无显著差异(P>0.05,n=11-16)。与雷帕霉素组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠转头时间和爬杆时间均无明显改变(P>0.05,n=8-11)。在实验周期的第九周末,与对照组相比,鱼藤酮组小鼠的转头时间明显增加(F=18.60,P<0.001,n=13-18),爬杆时间也明显增加(F=5.056,P<0.01,n=13-18)。与鱼藤酮组相比,美多芭组小鼠转头时间明显缩短(P<0.001,n=13-16),爬杆时间也明显缩短(P<0.05,n=13-16),其他三组小鼠转头时间均明显缩短(P<0.001,n=8-13),但是爬杆时间均没有显著性差异(P>0.05,n=8-13)。与美多芭组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠转头时间与爬杆时间均无显著差异(P>0.05,n=11-16)。与雷帕霉素组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠转头时间和爬杆时间也无明显改变(P>0.05,n=8-11)。2.转棒实验:在实验周期的第五周末,与对照组相比,鱼藤酮组小鼠在转棒上维持的运动时间明显缩短(F=2.726,P<0.05,n=13-18)。与鱼藤酮组相比,其他四组(美多芭组、雷帕霉素组、低剂量和高剂量柯诺辛组)小鼠在转棒上维持的运动时间均无显著性差异(P>0.05,n=8-16)。与美多芭组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠在转棒上维持运动的时间均无显著差异(P>0.05,n=11-16)。与雷帕霉素组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠在转棒上维持运动的时间也均无明显改变(P>0.05,n=8-11)。在实验周期的第九周末,与对照组相比,鱼藤酮组小鼠在转棒上维持的运动时间明显缩短(F=3.514,P<0.01,n=13-18)。与鱼藤酮组相比,其他四组小鼠在转棒上维持的运动时间均明显增长(P<0.05,n=8-16)。与美多芭组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠在转棒上维持的运动时间无显著差异(P>0.05,n=11-16)。与雷帕霉素组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠在转棒上维持运动的时间也无明显改变(P>0.05,n=8-11)。3.纹状体内多巴胺及其代谢产物的含量检测:采用高效液相法检测各组小鼠纹状体内的多巴胺及其代谢产物含量的变化。结果显示:与对照组相比,鱼藤酮组小鼠纹状体内的多巴胺含量显著下降(F=4.551,P<0.05,n=8-11),多巴胺代谢产物高香草酸(Homovanillic acid,HVA)(F=6.264,P<0.01,n=8-11)和二羟苯乙酸(2-Hydroxyphenylacetic acid,DOPAC)(F=4.476,P<0.05,n=8-11)的含量均明显降低。与鱼藤酮组相比,其他四组小鼠纹状体内的多巴胺含量均显著增加(P<0.05、P<0.01,n=5-10),多巴胺代谢产物HVA(P<0.01、P<0.05,n=5-10)和DOPAC(P<0.001、P<0.05,n=5-10)的含量均显著增加。与美多芭组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠纹状体内多巴胺及其代谢产物HVA和DOPAC含量无显著差异(P>0.05,n=6-10)。与雷帕霉素组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠纹状体内多巴胺及其代谢产物HVA和DOPAC的含量也无明显改变(P>0.05,n=5-6)。4.黑质区TH阳性细胞数的检测:采用免疫组织化学染色法检测小鼠黑质区TH阳性细胞数的变化。结果显示:与对照组相比,鱼藤酮组小鼠黑质区TH阳性细胞数显著减少(F=8.692,P<0.05,n=5-7);与鱼藤酮组相比,其他四组小鼠黑质区TH阳性细胞数均显著增加(P<0.05,P<0.001,雷帕霉素组:n=3,其他组:n=5-6);与美多芭组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠黑质区TH阳性细胞数无明显差异(P>0.05,n=5-6);与雷帕霉素组相比,低剂量和高剂量柯诺辛组小鼠黑质区TH阳性细胞数也无明显差异(P>0.05,雷帕霉素组:n=3,其他组:n=5)。5.黑质区小胶质细胞激活情况的检测:采用免疫荧光染色法检测各组小鼠黑质区小胶质细胞的激活情况。结果显示:与对照组相比,鱼藤酮组小鼠黑质区激活的小胶质细胞数目明显增加(F=13.48,P<0.01,n=5-7)。与鱼藤酮组相比,其他四组小鼠黑质区激活的小胶质细胞数目均明显减少(P<0.01、P<0.001,雷帕霉素组:n=3,其他组:n=5-6)。与雷帕霉素组相比,高剂量柯诺辛组小鼠黑质区激活的小胶质细胞数量明显减少(P<0.05,雷帕霉素组:n=3,其他组:n=5),而低剂量柯诺辛组小鼠黑质区激活的小胶质细胞数目无明显变化(P>0.05,雷帕霉素组:n=3,其他组:n=5)。综上所述,柯诺辛能够通过改善鱼藤酮诱导的PD模型小鼠的运动功能、增加纹状体内多巴胺的含量、减少黑质区多巴胺能神经元缺失和抑制小胶质细胞激活,从而发挥神经保护作用。