抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)是一种有效的肿瘤靶向治疗药物,由具有特异性靶向作用的单克隆抗体,具有强大细胞杀伤力的小分子细胞毒素和连接二者的连接物(linker)组成。以靶向性抗体为载体,将抗肿瘤活性极强的毒素带到肿瘤部位,提高抗体的活性的同时,扩大小分子毒素的治疗窗。目前ADC的研究主要以全长抗体为载体,以肿瘤组织高表达的肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,TAA)为靶点进行设计。然而抗体相对分子质量太大(约150 kDa),在组织结构紧密的实体瘤中渗透性低,造成ADC的体内利用率较低。抗体在ADC中主要起到肿瘤靶向作用,为了拓宽ADC概念的适用范围,研究者们尝试了以scFv和Fab等小型化抗体或者多肽等分子量更小的物质作为新型ADC的载体,来提高组织渗透性和降低免疫原性,但是由于半衰期短、亲和力低等原因,至今未获得成功。TAA虽然过表达于肿瘤组织,但是在部分正常细胞中也有少量表达,ADC在体内长时间循环过程中会部分蓄积到低表达抗原的正常组织内,造成“on-target-off-tumor”毒副作用,限制其临床应用。为此,本研究从新型载体和新型靶点的角度,设计新型ADC,以期扩大ADC的应用和提高安全性。对于新型载体的研究,我们以内源性配体TRAIL(TNF related apoptosis-inducing ligand)为载体,与毒素 MMAE 偶 联获得配体偶 联药物(ligand-drug conjugate,LDC),MMAE的偶联增强TRAIL活性的同时克服肿瘤细胞耐药问题。通过PEG长循环修饰,可提高TRAIL-MMAE的半衰期,增大偶联物的肿瘤蓄积。经过不同PEG和MMAE偶联物的亲和力比较,我们发现过多的PEG或过多的MMAE偶联都会减弱TRAIL偶联物的亲和力,且PEG影响更大,提示适当减少PEG的偶联比可能更利于TRAIL发挥活性。为了寻求PEG改善药动学性质和MMAE提高药效的双效平衡,我们对不同PEG和MMAE偶联比的PEG-TRAIL-MMAE的体内药动学、体内外活性及小鼠体内潜在毒性多方面进行评价,归纳出PEG:MMAE=1:2时,TRAIL偶联物的大鼠体内半衰期大大延长(从0.7h延长到6.8h),细胞亲和力、体外活性(IC50.31nM)和体内抗肿瘤效果最强,五只小鼠有三只的肿瘤完全消退,同时无明显毒性作用。说明该PEG-TRAIL-MMAE偶联物可成为一种有前景的新型配体偶联药物。对于新型靶点的研究,我们以HLA递呈的肿瘤特异性突变抗原(tumor-specific mutant antigens,TSMA)为靶点,以 KRAS Gly-12 突变/HLA-A0201 抗原为案例,设计抗体偶联药物。由于这类抗原属于个性化抗原,只有特定的蛋白突变和特定的HLA分型,才能成为目标抗原,因此我们将特异性靶向此类抗原的抗体命名为个性化抗体,其相应的偶联物即为个性化抗体偶联药物(personalized antibody-drug conjugate,PADC)。分别表达了用G12D多肽和G12V/HLA-A0201复合物两种抗原筛选的抗体后,在细胞水平检测抗体的抗原识别功能,我们发现以多肽为抗原筛选出的抗体无法识别细胞表面的递呈抗原,说明多肽结合HLA后构象发生了改变,这为今后其他TSMA靶向抗体的筛选提供借鉴。对G12V/HLA-A0201复合物的抗体及PADC的抗原识别进行评价,表明抗体和PADC都能特异性识别递呈的G12V抗原,且不识别G12D或者野生型抗原,证明了抗体能够识别单个氨基酸突变引起的抗原表位变化。在体外检测PADC的活性,发现其对自身HLA-A0201和KRAS G12V突变双阳性的结肠癌细胞系SW480并无明显效果,经过细胞系表面抗原量检测和外源添加多肽孵育实验,我们分析原因是细胞在自然条件下培养,本身递呈的抗原量太少,无法提供足够的PADC结合位点。在构建泛素融合的HUP稳定表达细胞株K562-A2HUP细胞上检测,G12V/HLA-A0201抗原表达量有所提高,内吞实验证明了 PADC结合细胞表面抗原后可以有效内吞。在构建的细胞株上检测DAR=1.85 和 3.65 的两个 PADC 的活性,IC50 分别为 214.6 nM 和 112.8 nM,2A5-MMAE携带的MMAE更多,体外活性比2E8-MMAE强,说明提高小分子毒素的载药量可以有效提高PADC的活性。虽然PADC活性远远弱于传统ADC的活性,相同DAR的偶联物IC50高出近100倍,但即使在高达400 nM的浓度下,PADC对抗原不表达的细胞株仍基本无毒性作用,证明了 PADC达到了绝对特异性靶向治疗的目标。这就提示我们,适当提高PADC的给药浓度,或许可以达到比较理想的治疗效果,且不以牺牲安全性为代价。此外,我们总结了 PADC设计中应着重考虑的关键因素:即较高的突变抗原的表达量、较强的突变多肽与HLA亲和力、高特异性和高亲和力的个性化抗体,以及较高的毒素载药量或偶联更强的细胞毒素,为后续更多的PADC设计和开发提供经验基础。