绵马贯众是鳞毛蕨科植物粗茎鳞毛蕨Dryopteris crassirhizoma Nakai的干燥根茎和叶柄残基,味苦,微寒,有小毒,归肝、胃经。具有清热解毒、驱虫等功效,用于虫积腹痛、疮疡。现在多用于炎症和感染性疾病。本课题组前期研究表明绵马贯众富含间苯三酚类成分的部位具有抗H5N1流感病毒作用,而目前对间苯三酚类单体化合物抗H5N1流感病毒的研究尚属空白。H5N1禽流感病毒致病性强,且能传染给人类,感染后人禽的死亡率高。因此,本研究采用分子对接技术对该药中的23个间苯三酚类化合物抗H5N1流感病毒活性进行了虚拟筛选,筛出具有较好活性的候选化合物,同时对绵马贯众药材进行提取分离,制备出相应的候选化合物,然后进行体内、外活性验证以寻找到抗病毒活性最强的化合物,进而对其抗病毒活性的免疫机制和安全性进行初步研究,此外,对有效部位中3个主要成分进行了 UPLC法含量测定,并对该部位在小鼠体内的代谢产物和代谢途径进行了分析。具体研究结果如下:第一部分 文献综述本文对绵马贯众中的化学成分和药理活性进行了文献综述,迄今为止已从绵马贯众中分离或鉴定出间苯三酚、黄酮、萜、甾、脂肪烃、芳香烃、苷、糖等不同类型的化合物,具有抗病毒（流感病毒、HIV、乙肝病毒、柯萨奇病毒）、抗菌、抗疟、抗炎、抗肿瘤、驱虫、免疫调节、抗氧化、抗衰老、镇痛、兴奋子宫、止血及雌激素样作用等。其中该药的抗病毒、驱虫、抗菌作用一直备受关注。研究表明间苯三酚类化合物为该药抗流感病毒的活性成分。因此,本论文对该药材中间苯三酚类化合物抗高致病性禽流感病毒H5N1的活性进行了研究。近年来,酚类成分的抗病毒活性报道引起广泛关注,而间苯三酚类化合物又是绵马贯众抗流感病毒的活性成分,因此本文通过查阅国内外文献总结发现:酚类化学成分对多种甲型流感病毒具有预防和抑制作用,毒副作用小,病毒不易对它们产生耐药性,而且和化药联用可抑制耐药性的产生,其抗病毒机制主要是抑制病毒与细胞的吸附、融合,降低病毒血凝素和神经氨酸酶蛋白的表达与合成,抑制病毒RNA的转录和病毒核糖蛋白的输出等,降低病毒导致的氧化应激损伤,此外,酚类化合物还可加强细胞免疫调节的功能,增强体液免疫。因此,可从酚类化合物中筛选出抗流感病毒的先导化合物。计算技术的发展极大地促进了生命科学的研究进程。计算技术已成为药物设计领域的重要手段之一,通过计算机模拟的分子对接运算,能快速准确地描述药物与靶标间的相互作用,本研究采用了分子对接技术对绵马贯众中的间苯三酚类化合物进行了抗H5N1流感病毒活性虚拟筛选,因此本文对分子对接技术及其在药物研发中的应用进行了文献综述,为后期绵马贯众中间苯三酚类化合物抗流感病毒活性筛选及构效关系研究奠定了基础。第二部分 实验部分2.1 绵马贯众中间苯三酚类化合物抗H5N1流感病毒活性筛选及构效关系分析为了从绵马贯众中筛选出抗高致病性禽流感病毒H5N1活性最强的间苯三酚类化合物,首先通过查阅文献,建立了由23个已从绵马贯众中分离得到的间苯三酚类化合物组成的小分子数据库,然后从PDB数据库中下载H5N1型流感病毒的神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）作为靶蛋白。本研究首次采用分子对接技术,利用Autodock Vina软件将23个间苯三酚类化合物与5种NA靶蛋白分别进行对接,结果表明23个化合物与NA均有较低的结合能（-6.8至-8.3 kal/moL）,然后选择能与NA活性口袋中重要氨基酸残基发生作用,且能同时嵌入NA蛋白的活性口袋和150-cavity的间苯三酚类单体作为候选化合物,结果共筛选得到6个候选化合物:绵马贯众素ABBA（GZ-A）、绵马酸ABA、绵马酸ABB、绵马酸ABP、黄绵马酸AB和白绵马素AA。对该类化合物抗H5N1病毒活性进行构效关系分析发现:母核不宜超过四个环,环数太多则难以进入NA活性空腔,不同母核间苯三酚类化合物活性由强到弱次序为:四环>三环>两环>五环>单环;其结构中的羰基和羟基是不可缺少的活性基团,二者数目越多,酰基侧链越短,活性越强。2.2 间苯三酚类化合物的分离制备为了获得6个间苯三酚类候选化合物,实验通过反复的硅胶柱层析、薄层制备和半制备高效液相等方法对绵马贯众药材进行分离,通过UV,IR,1H-NMR,13C-NMR,HMBC,HSQC,HR-ESI-MS等方法进行结构鉴定,共鉴定出13个间苯三酚单体化合物,包括2个间苯三酚四聚体:GZ-A（1）和绵马贯众素ABBP（2）;4个间苯三酚三聚体:绵马酸 ABA（3）、绵马酸 ABP（4）、绵马酸 ABB（5）和 Nortrisflavaspidic acid ABB（6）;7个间苯三酚二聚体:白绵马素AA（7）、白绵马素AP（8）、白绵马素AB（9）、白绵马素 PP（10）、白绵马素 PB（11）、Norflavaspidiacid AB（12）和黄绵马酸 AB（13）,其中化合物2和6为新化合物,化合物1、3、4、5、7和13为6个候选化合物。2.3 候选化合物抗H5N1流感病毒的体外活性研究实验采用经典的底物（4-MUNANA）荧光法,在验证6个候选化合物体外抑制NA活性的同时,亦对2个新化合物及富含GZ-A的GZP部位进行了体外活性评价。结果表明8个间苯三酚类单体化合物和GZP部位均具有一定的抑制H5N1流感病毒NA的作用。其中GZ-A、绵马酸ABA和GZP部位抑制NA的作用优于其它化合物,IC50值分别为 18.59±4.53 μM,29.57±2.48 μM 和 22.07±2.73 μg/mL。在此实验基础上,采用MDCK细胞通过CCK8法和CPE法,在生物安全三级实验室对GZ-A和绵马酸ABA的抗病毒活性进行了进一步验证,以奥司他韦为阳性对照药物。实验结果表明:GZ-A具有较好的直接杀灭病毒的作用,EC50值为18.45±2.69 μM。发现GZ-A抗病毒活性的EC50值与抑制神经氨酸酶的IC50值相近,推测该化合物的作用靶点为神经氨酸酶。2.4 GZ-A体内抗H5N1流感病毒活性及免疫机制研究为了探索在体外具有较高活性的GZ-A在小鼠体内是否也有活性,实验采用SPF级,18～20 g的BALB/c雌性小鼠120只,随机分为6组:空白对照组、感染对照组、GZ-A高、中、低剂量组、金刚烷胺组（20mg/kg）,每组20只。空白对照组点眼、滴鼻0.1 mL/只生理盐水,其它组小鼠均点眼、滴鼻给予病毒0.1 mL/只。攻毒后第2天开始给药,连续灌胃给药7d,每天灌胃1次。在给药前、给药最后一天分别称量小鼠重量并记录;于攻毒第7天和第14天观察每组小鼠的死亡情况,记录并计算小鼠存活率;然后每组随机处死5只小鼠,在无菌条件下取小鼠的肺脏,检测肺部病毒载量并计算肺指数（%）=肺脏重量/体重×100%。取肺脏支气管灌洗液,进行细胞因子测定。实验结果表明在给药剂量为高剂量时,小鼠的存活率达87%,且存活小鼠的体重明显增加;GZ-A组小鼠的肺指数和肺部病毒载量均低于病毒模型组,提示GZ-A有减轻感染H5N1病毒小鼠肺部炎症的作用;且GZ-A各给药组均呈现良好的量效关系,作用全部优于金刚烷胺组。进行该实验的同时对其作用机理也进行了初探,表明GZ-A可通过降低促炎因子IL-6、IL-12、INF-γ、IL-10和增加抗炎因子MCP-1、TNF-α等的表达来减轻感染病毒小鼠的肺部炎症。2.5 活性成分GZ-A体内外毒性研究为了解GZ-A的用药安全性,实验将通过犬肾细胞（MDCK）和ICR小鼠,观察GZ-A的细胞毒性和在小鼠体内可能出现的急性中毒症状、死亡等情况。体外实验结果表明:GZ-A给药剂量达400 μM时,对MDCK的抑制率才达到23.90±0.59%,表明GZ-A无明显的细胞毒副作用。急性毒性实验,以最大浓度（25 mg/mL）和最大灌胃体积（0.4 mL/10g）体积给予GZ-A后,小鼠未出现死亡和明显的中毒情况,脏器亦无明显可见的病理变化,给药剂量相当于临床成人绵马贯众药材日用剂量的57至222倍,因此GZ-A在常用剂量范围内安全性良好。2.6 绵马贯众抗H5N1流感病毒有效部位的含量测定前期实验结果表明绵马贯众GZP部位可明显抑制H5N1神经氨酸酶的活性,IC50值为22.07±2.73,说明该部位具有较好的抑制H5N1流感病毒的作用。因此,实验采用UPLC法对该部位所含的3个主要间苯三酚类化合物进行了含量测定,结果表明GZP部位中含GZ-A为74.71%,绵马酸ABB为4.95%,绵马贯众素ABBP为6.51%。2.7 有效部位的体内代谢产物研究由于目前对间苯三酚类单体化合物在体内的代谢产物研究尚属空白,为了探索抗流感病毒活性成分在体内的代谢产物和代谢途径,实验采用UPLC-LTQ-Orbitrap对绵马贯众抗H5N1流感病毒有效部位（GZP部位）在体内产生的代谢产物进行了分析。结果通过保留时间、裂解碎片和精确分子量鉴定等手段共检测到34个成分,在血浆中检测到4个原型成分和12个代谢产物;在尿液中未检测到任何原型成分,但有14个代谢产物;在粪便中检测到1个原型成分和23个代谢产物。代谢途径主要包括去亚甲基（-CH2）,氧化还原（+O-H2,-O+NH,+H2）,甲基化+氧化（+CH2+O）,去乙酰基（-C2H2O）,去丙酰基（-C3H4O）,去羟基（-OH）,半胱氨酸化（+C3H5ONS）,硫酸化（+SO3）等。通过本论文的研究,从绵马贯众所含间苯三酚类化合物中筛选出了抗高致病性禽流感病毒H5N1活性最强的化合物GZ-A,并从绵马贯众中分离得到2个新化合物;初步探索了 GZ-A抗病毒活性的免疫机制和可能的作用靶点（NA）,并初步明确了该化合物的安全性;对绵马贯众间苯三酚有效部位在体内的代谢产物进行了研究,并分析了此类化合物在体内可能的代谢途径。