荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)具有较高的蛋白质、脂质水解力,和良好的嗜冷性,是生鱼、肉类和乳制品中重要的革兰氏阴性腐败菌。群体感应是一种细胞间的交流机制,参与毒力因子分泌、生物被膜形成、食品腐败等的调控。现有研究表明希瓦氏菌、气单胞菌、假单胞菌等革兰氏阴性的致腐性与群体感应密切相关,然而,,P.fluuoescens中AHLs介导的QS系统分子信息及其调控生物被膜、腐败和抗胁迫性的机制的研究较少。鉴于此,本研究以冷藏腐败大黄鱼中分离鉴定的优势腐败菌P.fluorescensPF07为研究对象,采用生物报菌法和高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测PF07中的AHLs活性,利用基因框架测序技术预测PF07全基因组,并对获得的LuxI和LuxR蛋白进行生物信息学分析;构建并验证luxl和luxR基因缺失株,比较研究野生株和缺失株的生长、生物被膜、致腐表型及抗胁迫性差异变化,评价luxI基因缺失株中外源添加C4-HSL的影响;基于转录组学测序技术研究luxI和luxR基因缺失对P.fluorescens的基因表达及代谢通路的影响,旨在更加全面地了解致腐菌LuxI和LuxR系统,为研发新型食品保鲜剂提供理论支持。主要结果如下:研究发现PfuorescensPF07上清液中含有C4-HSL、C10-HSL和C14-HSL三种信号分子,且C4-HSL含量最高。PF07基因框架测序显示,预测全基因组大小约为6.59Mb,编码基因约5573个,长度约为5,352,570bp。PF07中预测出的ncRNA 有 3 种(tRNA,rRNA 和 sRNA),Prophage 有 6 个,CRISPRs 有 70 个,次级代谢产物基因簇6种,其中hserlactone(homoserine lactone)是与群体感应相关的基因簇。采用COG聚类分析PF07功能时,从Signal transduction mechanism类型的基因中发现群体感应相关的合成酶GM004424(LuxI)和受体蛋白GM004425(LuxR)。两个蛋白的生物信息学分析发现,PF07中LuxI/LuxR与荧光假单胞菌PFuk4中同源蛋白具有高度的同一性和相似性,并且与其他菌株中六种LuxI型合成酶和LuxR受体蛋白具有相同的保守氨基酸和相似的蛋白质3D结构,因此认为PF07中LuxI/LuxR是一对同源的群体感应合成酶和受体蛋白。构建了P.fuorescensPF07luxl和luxR基因缺失株,比较分析野生株及两株突变株△luxI/△luuxR在生物被膜形成、致腐能力和抗胁迫性间的差异,并评价C4-HSL添加对△luxI的影响。结果发现,缺失株△luxI中C4-HSL几乎散失,△luxR中降低约38.60%,但对C10-HSL和C14-HSL活性无影响。在30℃和4℃下luxI和luxR基因缺失对细菌生长无影响,分别在18 h和144 h达到稳定期。luxI和luxR基因缺失都导致生物被膜的形成减弱,且降低细菌的粘附能力及胞外多糖形成量,却促进细菌泳动性。△luxI和△luxR在30℃下被膜结晶紫量分别降低17.22%和14.56%,而4℃分别减少27.51%和22.48%;C4-HSL部分回补被膜含量,30℃和4℃下最高分别回复12.82%和23.66%。CLSM显示两种温度下△luxI和△luxR形成的被膜都更薄且结构较疏松,SEM观察到AluxI和AluxR胞外分泌物减少。luxI和luxR基因缺失也降低菌体胞外蛋白酶和嗜铁素的产生,特别是蛋白酶活性,最高时分别降低了 11.94%和12.51%,但不影响TVB-N含量。外源添加C4-HSL可部分恢复△luxl中嗜铁素和蛋白酶的缺陷,其中对蛋白酶作用较弱,最高仅能恢复 9.2%。此外Aluxl和AluxR在20mM H2O2、30%(m/v)NaCl、50℃和 150μg/mL结晶紫中的抗胁迫力弱于野生株,其中H2O2处理三者间差异最大,野生株的存活率分别是△luxR和AluxI的15.31倍和18.71倍。转录组学分析显示,P.fuorescensPF07中LuxI/LuxR敲除会影响多种生物被膜相关的基因,包括下调多糖相关的基因、上调pst系统相关的基因,AluxR中还上调PhoB/U双组分系统。而对pst系统与PhoB/U双组分系统基因上调,可能导致下调细胞内c-di-GMP含量,从而促进细胞的泳动性。同时,两个缺失株△luxI和△luxR中参与胞外蛋白酶产生(aprX),嗜铁素生物合成(ornithine monooxygenase)和应激反应(rpos、OmsC、HslV)基因的下调。还有在△luxR和△luxI中其他与腐败相关基因的表达水平也下调,如脂质代谢,硫化合物代谢,芳香族化合物和氨基酸代谢,异味产生等;LuxR在△luxI中的表达水平下调。外源添加C4-HSL仅恢复AluxI的部分基因,如与嗜铁素合成相关的基因ornithine monooxygenase、与多糖合成相关的基因 polysaccharide biosynthesis protein,与绿脓素产生相关基因pyocinR2holin,与应激反应相关基因osmC,hslV等。采用荧光定量PCR,研究验证aprX、fihA、luxI、luxR、orm、pbp和rpoS基因在四组菌中表达量的变化,其结果与转录组测序基本一致,且都能映证表型变化的结果,证明转录组测序结果较为可靠。研究表明,LuxI/LuxR是荧光假单胞菌PF07中一对同源的群体感应合成酶和受体蛋白,且LuxI/LuxR能通过上调多糖相关的基因、下调pst系统相关基因及PhoB/U双组分系统基因来促进生物被膜的形成,上调胞外蛋白、嗜铁素、脂质代谢等腐败相关基因来促进腐败,以及上调应激反应相关基因来提高其抗胁迫性。从生理表型和基因表达差异变化,证实了群体感应LuxI/LuxR对荧光假单胞菌被膜形成、致腐能力以及抗胁迫性的正向调节作用。