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背景:牙周病是一种以牙菌斑为始动因素的慢性感染性疾病,是人群中发病率最高的疾病之一。第四次全国口腔健康流行病学调查显示,我国35岁及以上各年龄组牙周健康率均不足10%,牙周病是导致成年人牙齿丧失的首要原因,严重影响患者口腔健康及全身健康。近年来越来越多的研究表明,维生素D3与牙周炎密切相关。牙周结缔组织中已知的维生素D通路,即从25羟维生素D3[25（OH）D3]经过1α羟化酶CYP27B1羟化形成1 α,25 二羟维生素 D3[1,25（OH）2D3],1,25（OH）2D3与维生素 D 受体（Vitamin D receptor,VDR）结合,促进牙周结缔组织细胞产生人源阳离子抗菌肽18（Human cationic antimicrobial protein 18,hCAP-18）,hCAP-18在分泌到细胞外后经过蛋白酶的进一步剪切形成活性形式LL-37,发挥生物学功能。牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS）通过激活牙周结缔组织细胞的Toll样受体2/4（Toll-like receptor2/4,TLR2/4）与 25（OH）D3 产生协同作用,进一步上调LL-37 的产生。LL-37亦可作用于牙周结缔组织细胞,减少白细胞介素8（Interleukin8,IL-8）和单核细胞趋化蛋白1（Monocytechemotactic protein1,MCP-1）的产生。此外,有研究发现在牙周结缔组织中,维生素D3需要经过2步羟化反应才能转变为活性形式发挥功能,首先在25羟化酶CYP27A1的作用下,形成25（OH）D3,其后在CYP27B1的作用下转变为活性形式1,25（OH）2D3。25（OH）D3由维生素D3经过CYP27A1羟化形成,那么维生素D3和25羟化酶CYP27A1是否参与牙周结缔组织细胞中的维生素D通路?这一问题尚未见相关报道,值得深入研究。本课题组之前的研究发现,牙周健康者血浆中25（OH）D3的浓度显著低于侵袭性牙周炎患者血浆中25（OH）D3的水平,且经过牙周基础治疗后,侵袭性牙周炎患者血浆中25（OH）D3的浓度显著下降,提示25（OH）D3和牙周炎症密切相关,可能在牙周免疫防御中发挥作用。作为25（OH）D3前体的维生素D3和形成25（OH）D3的关键酶CYP27A1在牙周免疫防御中的作用及机制如何,亟待进一步研究。目的:探讨维生素D3和25羟化酶CYP27A1是否参与牙周结缔组织细胞中的维生素D通路及其在牙周结缔组织细胞中抗菌及抗炎的机制,分析维生素D3和25羟化酶CYP27A1在牙周结缔组织免疫防御中的作用,进一步深入理解维生素D3与牙周炎的关系,为临床应用维生素D3防治牙周病提供理论依据。方法:第一部分:体外原代培养3名受试者的人牙周膜细胞,取第Ⅳ或Ⅴ代细胞,采用real-time PCR检测其在不同培养条件（维生素D3、25（OH）D3、Pg-LPS、Pg-LPS+维生素D3及Pg-LPS+25（OH）D3）下,hCAP-18、CYP27A1、IL-8和MCP-1的mRNA表达特点;采用ELISA检测LL-37、IL-8和MCP-1蛋白表达特点;同时利用siRNA抑制人牙周膜细胞CYP27A1表达,观察其作用。第二部分:体外原代培养3名受试者的人牙龈成纤维细胞,取第Ⅳ或Ⅴ代细胞,采用real-time PCR检测其在不同培养条件（维生素D3、肿瘤坏死因子α[Tumor necrosis factorα,TNF-α]、TNF-α+维生素 D3）下,β 防御素 2（Human β defensin2,HBD-2）、β 防御素3（Human β defensin 2,HBD-3）、CYP27A1、IL-8、MCP-1、p65、VDR 和TLR2的mRNA表达特点;采用ELISA检测HBD-2、HBD-3、IL-8和MCP-1的蛋白表达特点;采用Western blot检测TLR2、VDR、p65和磷酸化p65的蛋白表达特点;同时利用siRNA抑制人牙龈成纤维细胞CYP27A1表达,观察其作用。结果:第一部分:在人牙周膜细胞中,相比于对照组,维生素D3和25（OH）D3刺激均能显著升高h CAP-18/LL-37的表达,而且维生素D3的效应弱于25（OH）D3;随着维生素D3刺激时间的延长,hCAP-18/LL-37表达增高;抑制CYP27A1的表达能够显著降低维生素D3所引起的hCAP-18/LL-37的表达;进一步研究发现维生素D3及Pg-LPS对CYP27A1的mRNA表达无显著影响;并且维生素D3能够显著抑制Pg-LPS所引起的IL-8及MCP-1的表达。第二部分:在人牙龈成纤维细胞中,维生素D3能够显著上调HBD-2及HBD-3的表达;随着维生素D3刺激时间的延长,HBD-2及HBD-3表达增高;抑制CYP27A1的表达能够显著降低维生素D3所引起的HBD-2及HBD-3的表达;进一步研究发现在TNF-α 作用下 HBD-2、HBD-3、IL-8、MCP-1、VDR、TLR2 和 p65 的表达显著上调,并且维生素D3能够显著抑制TNF-α所引起的HBD-2、HBD-3、IL-8、MCP-1、VDR、TLR2及p65的表达以及p65的磷酸化。结论:以上两部分研究结果提示,维生素D3及25羟化酶CYP27A1参与牙周结缔组织细胞中维生素D通路。维生素D3能够上调抗菌肽LL-37、HBD-2和HBD-3的表达,抑制炎症介质所上调的促炎因子IL-8、MCP-1的表达,在牙周结缔组织免疫防御中可能发挥重要作用。