癫痫是一种慢性脑部疾病,其特征为大脑神经元异常同步放电引起的脑功能短暂失常。电压门控钠通道Nav1.6亚型在中枢神经系统中的谷氨酸能兴奋性神经元特异性高表达,在神经元动作电位的爆发和传导中发挥关键功能。人类遗传学研究表明Nav1.6功能增强（gain of function）突变导致多种类型的癫痫疾病,如良性家族性新生儿-婴儿癫痫和发育性癫痫脑病。啮齿类动物中,敲入Nav1.6功能增强型突变体诱发癫痫表型,敲除Nav1.6基因能够降低电点燃大鼠癫痫中发作的阈值,且癫痫发作时间比野生型显著性降低。因此,Nav1.6通道被认为是潜在的抗癫痫药物靶点。目前已发现了超过200个致癫痫的Nav1.6突变,其中超过50%的突变体的通道特征未被阐明;但是目前靶向Nav1.6小分子抑制剂较少,阻碍了靶向该通道的抗癫痫药物研发。Nav1.6致癫痫突变主要集中在跨膜螺旋片段,失活门和2/3的C端。研究发现诱发癫痫的Nav1.6突变主要为功能增强型突变,这些突变体对通道的损害包括过早开放、延缓失活和增加持续性钠电流。我们利用定点突变技术构建了25个位于上述三个高频区域的Nav1.6致癫痫突变体,结合手动膜片钳技术,我们对其中未有功能报道的高频突变开展了系统的电生理特性研究。和之前报道一致,我们发现大部分癫痫相关突变体同时存在过早开放、失活受损或增加持续性钠电流的情况。然而,小部分癫痫相关突变体（如N1466T、N1466K和F1754S等）只显著增加通道的持续性钠电流而对其余三个通道特征无明显影响。该结果提示,持续性钠电流可能是此类突变体诱发癫痫的重要通道特征。N1466T和N1466K突变是位于失活门区域的同一位点的两个突变,携带患者临床上表现出不同的发病时间和严重程度。除显著增加通道的持续性钠电流和斜坡电流外,这两个突变还使得电压依赖性慢失活朝着超极化的方向移动,而对于通道的电流密度、电压依赖性激活和失活特征无显著影响。其中,N1466K突变显著增加通道稳态快失活、慢失活的时间常数和减少稳态快失活恢复的时间,而N1466T减少了稳态快失活恢复的时间,但对其他通道特征无显著影响。这些电生理数据表明,N1466T和N1466K属于Nav1.6功能增强型突变。非选择性钠通道抑制剂是临床上常用的抗癫痫药物,其中托吡酯对携带N1466T或N1466K突变的患者在临床上显示有效。因此我们考察了托吡酯对N1466T和N1466K的效应,发现托吡酯选择性抑制突变体的持续性钠电流和斜坡电流,而对瞬时电流峰值无影响,提示抑制持续性钠电流和斜坡电流可能是其治疗Nav1.6致癫痫突变的重要机制。基于此,我们进一步评价了临床常用抗癫痫药物奥卡西平、拉科酰胺、卡马西平、苯妥英、拉莫三嗪和丙戊酸对N1466T和N1466K突变的持续性钠电流和斜坡电流的影响。结果表明,相比于托吡酯,卡马西平和苯妥英对N1466T和N1466K突变体的持续性钠电流和斜坡电流的抑制率显著增强,提示卡马西平和苯妥英也可作为此类突变体携带患者的潜在治疗药物。基于Nav1.6通道在癫痫疾病产生和治疗中的重要作用,我们与药物化学家合作开展了小分子抑制剂发现工作。首先采用手动膜片钳技术检测了与在临床二期研究结构具有一定相似性的已有化合物,发现了数个具有Nav1.6抑制性的小分子。以这些活性分子为原型开展了系统的构效关系优化,进一步发现了以NK728为代表的多个对Nav1.6通道具有较强抑制效应的抑制剂,其在体外可降低原代神经元兴奋性。通过最大电休克模型评价上述分子的抗癫痫活性,发现了数个可有效抑制小鼠癫痫发作的化合物。该工作为靶向Nav1.6通道抗癫痫候选化合物的发现奠定了基础。