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杀菌/渗透性增强蛋白(Bactedcidal/permeability increasing protein,BPI)是存在于人、牛、猪等多种哺乳动物嗜中性粒细胞中的一种分子量为55KD的阳离子抗菌蛋白,最近研究发现BPI不仅存在于中性粒细胞中,也存在于人和小鼠未成熟DC和肠粘膜组织/上皮细胞中。目前尚不知晓在上述组织细胞中表达的BPI除抗感染作用外,还具有何种生理/病理学意义。课题组在首次证实小鼠DC表达BPI基础上,根据(1)正常人/鼠体液中存在低浓度LPS;(2)体内绝大多数DC处于未成熟状态；(3)DC具有LPS受体(CD14/TLR4)可接受LPS刺激分化为成熟DC的生理现象:提出“DC表达的BPI可通过对环境中LPS的中和作用使DC处于未成熟状态”的假说,并通过BPI基因敲除小鼠模型的建立及其相关研究工作加以验证。本科题是BPI基因敲除小鼠模型的建立第一阶段的研究工作,即BPI条件基因打靶杂合子小鼠的获得。
主要研究内容和结果：
1.利用生物信息学方法,采用ClustalW软件对C57BL/6J小鼠及人类BPI氨基酸序列进行序列比对,结果发现二者氨基酸序列有53％完全相同,相似度达71％。采用SMART软件对C57BL/6J小鼠BPI氨基酸功能区结构域进行预测分析,发现其N端第1～27位氨基酸为信号肽序列,N端第36～259位氨基酸是具有中和内毒素和杀菌作用的功能片段。
2.BPI条件基因打靶载体的构建:(1)采用Cre/LoxP系统,选择小鼠BPI基因第2、3外显子作为条件性敲除的目的片段,并在其两侧插入两个方向相同的LoxP位点；(2)运用LA-PCR技术,以129/SvJ品系小鼠ES细胞基因组DNA为模板分步扩增包括BPI第2、3外显子(中间同源臂)和上游同源臂在内的3.1kb基因片段以及下游同源臂4.9kb基因片段；(3)构建pBSKⅡ-5SLoxP和pLoxPFRTNeo-3L重组质粒,将前者酶切产物(3.1kb)与酶切后的pLoxPFRTNeo-3L质粒相连获得BPI条件基因打靶载体。
3.BPI条件基因打靶载体对ES细胞的转染和中靶ES细胞的筛选:(1)采用电穿孔法,在600 V、25μF、32ms条件下,将NotⅠ酶切线性化的打靶载体转入小鼠胚胎干细胞(ES,129/SvJ)中,使外源DNA与ES细胞基因组中相应基因片段发生同源重组；(2)通过G418和Gancyclovir正负筛选获得140株抗性ES细胞克隆；(3)采用PCR法进行初筛后,确定候选中靶ES细胞为6株；提取上述中靶ES细胞DNA后进行测序鉴定,证实上述6株ES细胞均为中靶细胞,中靶概率为4.2％。
4.采用显微注射法将中靶ES细胞导入受体C57BL/6J小鼠的囊胚腔后,将其移植给假孕雌鼠,获得新生小鼠6只；采用PCR法对其进行基因型鉴定,证实其中5只是BPI条件基因打靶嵌合体小鼠。将上述高嵌合度小鼠与C57BL/6J小鼠交配后,共繁育仔鼠31只,其中21只是棕色小鼠,采用PCR法对上述棕色小鼠进行基因型鉴定,证实其中13只是BPI条件基因打靶杂合子小鼠。
结论：
本研究已成功获得BPI条件基因打靶杂合子小鼠,为BPI条件基因打靶纯合子小鼠和BPI基因敲除小鼠的建立奠定了基础。论文对BPI在DC中表达的生理、病理学意义进行了探讨:首次提出“DC表达的BPI可通过对环境中LPS的中和作用使DC处于未成熟状态”的假说。