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草鱼出血病（Grass carp hemorrhagic disease,GCHD）是对草鱼威胁最大的病害之一,给草鱼养殖业带来重大经济损失。目前,Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus type Ⅱ,GCRV-Ⅱ）是引起GCHD爆发的最主要病原,疫苗免疫是预防GCHD的重要方法。其中浸泡免疫方式具有省时省力和便于商业化推广等优点,但是疫苗通过浸泡途径对鱼体进行免疫又有难以突破生物屏障发挥免疫作用的问题。本研究通过基因工程技术对GCRV-Ⅱ VP4蛋白进行抗原表位筛选,以碳纳米管（Single wall carbon nanotube,SWCNTs）为载体、甘露糖（Mannose）为靶向因子构建具有靶向免疫功能的碳纳米管载疫苗系统,评价疫苗的免疫保护效果,并优化免疫程序,确定可产业化的免疫保护方案。主要内容包括以下几个方面:1.VP4蛋白优势抗原表位筛选根据GCRV-Ⅱ代表株的vp4基因序列（1953 bp）将其截短分为4段,分别构建含有p ET32a-vp4、p ET32a-vp4-1、p ET32a-vp4-2、p ET32a-vp4-3和p ET32a-vp4-4（vp4-1片段大小为534 bp,vp4-2、vp4-3和vp4-4片段大小为537 bp）原核表达质粒的基因工程株。通过双酶切和测序验证后导入Escherichia coli BL21（DE3）诱导表达蛋白,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹法检测蛋白表达与活性。最后采用酶联免疫吸附测定法对蛋白进行优势抗原表位筛选,结果显示VP4-3的OD450值为1.7609显著高于其它蛋白,可作为预防GCHD候选疫苗抗原。2.靶向性碳纳米管载疫苗系统制备以SWCNTs为载体、Mannose为靶向因子分别构建碳纳米管载亚单位疫苗系统（SWCNTs-VP4和SWCNTs-VP4-3,其中VP4和VP4-3抗原蛋白分别约占52.23%和53.19%）,靶向性碳纳米管载亚单位疫苗系统（SWCNTs-M-VP4-3,其中VP4-3抗原蛋白约占45.27%）。通过不同浓度（5、10、20、40和80 mg/L）的靶向性碳纳米管载疫苗系统对草鱼进行浸泡免疫6 h,免疫28 d后,安全性检测结果显示草鱼机体活动正常,死亡率均在10%以下;与对照组相比脂肪酶和淀粉酶的活性、生长性能、肌肉生长发育相关基因表达量（Myf-5、Myo D1和Myo G）均没有显著差异。本章成功构建防治草鱼出血病的靶向性碳纳米管载疫苗系统,80 mg/L以内对草鱼相对安全。3.靶向性碳纳米管载疫苗系统免疫效果研究以VP4（5.0 mg/L）、SWCNTs-VP4（1.0 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L）、SWCNTs-VP4-3（1.0 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L）和SWCNTs-M-VP4-3（1.0 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L）不同疫苗系统对草鱼浸泡免疫6 h,通过测定免疫相关生理指标、血清抗体效价、免疫相关基因表达和相对免疫保护率,评价该疫苗系统的免疫保护效果。结果显示:与其它组相比,SWCNTs-M-VP4-3组的免疫相关基因表达水平、免疫相关生理指标以及血清抗体效价水平均显著升高。病毒攻毒结果显示SWCNTs-M-VP4-3的最高浓度组的免疫保护率最高为60.95%,而SWCNTs-VP4-3、SWCNTs-VP4和VP4组的最高浓度组相对免疫保护率分别为51.43%、42.86%和33.33%。由优势抗原制成的靶向性碳纳米管载疫苗系统通过浸泡免疫可以有效增强草鱼对GCHD的免疫保护效果。4.疫苗应用效果研究通过完全试验对SWCNTs-M-VP4-3疫苗系统的不同免疫参数进行优化,即不同免疫浓度（5、10和20 mg/L）、免疫时间（6、12和24 h）和不同浸泡密度（15、30、60尾/L）,采用浸泡方式对草鱼进行免疫,评价疫苗的免疫保护效果。由攻毒试验的结果可知,当免疫时间12 h、免疫浓度10 mg/L为和浸泡密度15尾/L时,免疫保护率最高为88.33%。免疫相关生理指标、血清抗体效价和免疫相关基因表达水平的结果也得出相同的结论。依照上述的免疫方案对某鱼种场的草鱼进行浸泡免疫。病毒攻毒结果表明对照组的平均存活率为11.83%,草鱼处理组的平均存活率为84.67%,相对免疫保护率为82.61%。通过此方案对草鱼进行浸泡免疫,可以显著提高鱼苗的存活率。综上所述,本论文成功筛选GCRV-Ⅱ VP4蛋白优势抗原表位,制备具有靶向功能的碳纳米管载疫苗系统,可实现对草鱼的高效保护,并且通过免疫程序优化确定最合适的免疫方案为疫苗浸泡免疫时间12 h,免疫浓度10 mg/L,浸泡密度30 g/L。在鱼种场进行产业应用取得较好的成果,具有重大实践意义。本研究将为其它水产动物纳米载疫苗系统提供新的思路,可以给水产养殖的其它疫苗推广提供一定的参考。