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猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)为单股正链RNA病毒,与鼠乳酸脱氢酶增高病毒、马动脉炎病毒和猴出血热病毒同属套氏病毒目动脉炎病毒科,是全球性猪传染病—猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的病原。该病以母猪发生繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高热和高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。由于PRRSV表现出较其他RNA病毒更高的突变率,同时具有破坏宿主固有免疫系统的潜能,且迄今为止尚无有效的弱毒苗或灭活疫苗控制该病的发生与传播,PRRS几乎在世界上所有的养猪国家均有流行,造成了巨大的经济损失。本实验室早期研究证明PRRSV感染可产生针对GP5蛋白的抗独特型抗体,该抗体在机体抗病毒免疫应答及疾病转归中发挥重要作用;并且通过顺序免疫法得到了在功能上模拟PRRSV GP5蛋白的单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2,研究证实该抗体仍保留自身抗独特型抗体的特性并且可下调弱毒苗对猪只的免疫保护作用。前期研究结果提示抗独特型抗体的功能较为复杂,其调控机体免疫应答的机制尚需要深入研究。然而,通过猪血清获得抗独特型抗体的数量有限且动物试验花费较大耗力较多,因此,构建细胞内表达单链抗体的细胞模型用于抗独特型抗体功能和免疫机制的前期研究更为理想。本论文的主要研究目的是构建抗独特型单链抗体的真核表达载体,经慢病毒转导使其在MARC-145细胞中表达,通过研究胞内表达抗独特型抗体后PRRSV的复制和增殖情况,验证其对病毒感染的影响并初步探索其产生机制。本课题研究的内容和结果如下:1.通过RT-PCR方法从Mab2-5G2杂交瘤细胞中分别扩增出重链可变区和轻链可变区基因,测序正确后通过弹性连接子(GGGGS)3经Overlap PCR连接组成一个完整的单链可变区抗体(scFv);再用GPGP连接子将5G2scFv和EGFP融合表达并连接至慢病毒表达载体;以抗禽戊型肝炎病毒E抗原单克隆抗体1B5为模板,构建1B5scFv作为对照,构建质粒分别命名为pTRIP-CMV-5G2scFv-GPGP-EGFP-IRES-Puro和pTRIP-CMV-1B5scFv-GPGP-EGFP-IRES-Puro。测序结果证实慢病毒载体构建成功。2.使用293T细胞包装重组慢病毒,收集细胞上清将表达5G2scFv和1B5scFv的重组慢病毒转导MARC-145细胞,经嘌呤霉素抗性筛选和增强绿色荧光蛋白(EGFP)筛选单克隆。间接免疫荧光试验和Western blot试验证实5G2scFv或1B5scFv在MARC-145细胞中稳定表达,细胞系构建成功,分别命名为MARC-5G2scFv和MARC-1B5scFv。细胞活力试验结果提示细胞内表达单链抗体不影响细胞活力。3.为了验证细胞内表达5G2scFv是否抑制PRRSV在MARC-145细胞中的复制增殖,本研究对MARC-5G2scFv细胞系进行了攻毒试验。SD16和VR-2332毒株感染48h后,通过Western blot和TCID50方法分别检测N蛋白和子代病毒的产生。试验结果显示N蛋白表达量在MARC-5G2scFv细胞中显著下降,而在MARC-1B5scFv细胞和MARC-145中不受影响;与上述发现一致,同一时间MARC-5G2scFv上清中的病毒滴度也显著降低(P<0.05)。而且,该抑制作用在0.01MOI、0.1MOI和1MOI的接毒剂量时均可出现。接毒后不同时间收集上清并测定各组样品毒价后提示MARC-5G2sc Fv细胞上清中病毒滴度显著低于MARC-1B5scFv细胞和MARC-145细胞(P<0.05),且在接毒后12h最为明显(P<0.001)。4.通过病毒吸附试验和检测I型干扰素表达初步探讨胞内表达5G2scFv下调病毒复制增殖的机制。荧光定量PCR和病毒滴度检测结果显示病毒吸附并无明显改变(P>0.05),提示胞内表达5G2scFv不影响病毒吸附MARC-145细胞。I型干扰素转录和表达检测结果显示,接毒48h后,MARC-5G2scFv细胞中IFN-α的转录和表达较未感染的MARC-5G2scFv细胞及感染后MARC-1B5scFv和MARC-145细胞明显升高(P<0.05),而在MARC-1B5scFv和MARC-145细胞中无明显变化(P>0.05);但是三组细胞中IFN-β的转录和表达在感染前后均无明显改变(P>0.05)。以上结果提示胞内表达5G2scFv抑制病毒感染可能与IFN-α表达上调有关。综上所述,本研究通过构建抗独特型单链抗体并使其在MARC-145细胞中稳定表达,对5G2scFv胞内表达会否影响的PRRSV感染及其机制进行了一系列的研究。本试验首次构建稳定表达抗独特型单链抗体的MARC-145细胞系;证明其胞内表达可抑制病毒复制增殖;该作用并非通过抑制病毒吸附实现而与IFN-α分泌增加相关。本研究拓展了抗独特型单链抗体的应用,为寻找新的治疗方法和疫苗提供了新思路。