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背景和目的脑出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是极具破坏性的卒中亚型,约占全部卒中的12%～20%,30天内死亡率高达43%～51%,且预后较差,大多数幸存者遗留有与出血部位相关的神经功能障碍,目前尚缺乏有效的特异性治疗措施。尽管外科手术在ICH后引起的原发性脑损伤方面取得了重大进展,但在ICH后继发的炎症级联反应方面进展甚微。越来越多的证据表明,炎症反应是导致ICH后继发性脑损伤的关键因素,其中小胶质细胞/巨噬细胞是导致ICH后继发性脑损伤的主要细胞类型,与其有关的炎症因子包括细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)、凝血酶等。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Extracellular Matrix MetalloPRoteinase INducer,EMMPRIN,CD147),是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白,属于免疫球蛋白(Immune globulin,Ig)超家族,包括两个胞外(Extracellular,EC)Ig 样结构域,ECI和ECII。EMMPRIN的每个结构域可以与不同的蛋白结合,从而表现出不同的功能,其中,EMMPRIN的ECI结构域已经被确认为MMPs的刺激诱导位点,在ICH中通过调控MMPs使其表达上调。脑血疏口服液的主要成分包括水蛭、黄芪、川芎等,研究表明,其有效成分可通过血脑屏障,主要用于出血性脑卒中。临床研究证实,常规治疗加用脑血疏口服液可降低ICH患者的炎症反应、加速脑内血肿的吸收,减轻脑水肿,改善患者的神经功能障碍。相关研究表明,脑血疏口服液可通过降低MMP-9的水平,从而改善ICH后的继发性脑损伤。MMPs与中枢神经系统的炎症过程相关,引起特殊关注的是其可使凋亡分子转变成激活形式,从而导致髓鞘降解、血脑屏障的破坏和组织损伤,加剧炎症反应,进一步加重ICH后的脑损伤。然而EMMPRIN作为MMPs的上游调节因子,目前尚无关于脑血疏口服液是否可以通过抑制EMMPRIN的表达改善ICH后脑损伤的相关研究。本研究通过构建大鼠ICH模型,明确EMMPRIN在ICH后脑损伤中不同时间点的表达变化,及其对ICH后脑损伤在不同时间点的组织病理学评估,进而探讨脑血疏口服液是否可以通过抑制EMMPRIN的表达这一新的治疗靶点来改善ICH后的脑损伤,为临床上应用脑血疏口服液治疗ICH提供新的科学依据。方法(1)将96只成年雄性SD大鼠随机分为ICH对照组(32只)、假手术组(Sham组、32只)、脑血疏口服液治疗组(NXS治疗组、32只),每组再按给药时间(1d、2d、3d、7d)分为4个亚组,每个亚组8只大鼠。(2)Sham组注射同等剂量的无菌生理盐水,其余两组将0.5μL的VII型胶原酶注入大鼠右侧纹状体制备ICH模型。(3)NXS(脑血疏口服液)治疗组:于造模后24h,给予灌服脑血疏口服液1mL/Kg,每8h给药一次,直至在相应的时间点处死,Sham组及ICH对照组给予灌服同等剂量的生理盐水。(4)神经行为学评定,明确脑血疏口服液对ICH大鼠神经功能改善情况。(5)每组大鼠分别于设定的研究终点(1d、2d、3d、7d)处死,取脑组织,制作石蜡切片。(6)分别检测不同时间点各组大鼠脑组织EMMPRIN的表达变化情况,以及对各组大鼠的ICH后脑损伤进行组织病理学评估,通过HE染色评估ICH后不同时间点脑损伤面积;Fluoro-Jade B染色观察不同时间点神经细胞的变性情况;Iba1免疫荧光染色观察不同时间点小胶质细胞的激活情况;TUNEL荧光染色检测不同时间点细胞的死亡(包括凋亡和坏死)情况。(7)通过对上述指标的统计分析,验证脑血疏口服液是否可以通过抑制EMMPRIN的表达改善ICH后脑损伤。结果(1)脑血疏口服液治疗7天后,ICH大鼠的神经功能缺损程度较前得到改善(P<0.05)。(2)EMMPRIN免疫组化结果统计分析示,EMMPRIN在ICH后表达增加,于ICH后2～3天表达最多,之后逐渐下降,至7天时仍有表达。分别于ICH后1d、2d、3d、7d,与Sham组相比,NXS治疗组和ICH对照组的EMMPRIN阳性细胞数均显著增多(P值均<0.001),且NXS治疗组的EMMPRIN阳性细胞数显著低于ICH对照组(P<0.01)。(3)HE染色结果统计分析显示,ICH后导致脑组织破坏,且在ICH后2～3天脑损伤面积最大,至7天时有所恢复。在ICH后1d、2d、3d、7d,Sham组除针道损伤外未见明显出血损伤,与Sham组相比,NXS治疗组和ICH对照组的脑损伤面积均显著增大(P值均<0.001)。仅在ICH后7d,与ICH对照组相比,NXS治疗组可显著缩小ICH后脑损伤面积(P<0.01)。(4)Fluoro Jade B(FJB)染色结果统计分析显示,神经元的变性死亡在ICH后逐渐增加,于3d达到高峰,之后逐渐下降,7d仍有表达。在ICH后1d、2d、3d,NXS治疗组和ICH对照组的FJB阳性细胞数均显著高于Sham组(P值均<0.001),ICH后7d,与Sham组相比,FJB阳性细胞数无统计学差异。且在ICH后3d和7d,NXS治疗组的FJB阳性细胞数显著低于ICH对照组(P<0.01)。(5)Iba1免疫荧光结果分析显示,在ICH后24h,Iba1阳性细胞数明显增多,于2～3d达到高峰,之后逐渐下降,7d仍较高表达。分别在ICH后1d、2d、3d、7d,NXS治疗组和ICH对照组在脑损伤区的Iba1阳性细胞数均显著高于Sham组(P值均<0.001),且在ICH后3d、7d,NXS治疗组的Iba1阳性细胞数显著低于ICH对照组(P<0.001)。(6)TUNEL染色结果统计分析显示,ICH后脑损伤区可见较多死亡细胞,且在ICH后3天达到峰值,至ICH后7天时死亡细胞数明显减少。分别在ICH后1d、2d、3d、7d,NXS治疗组和ICH对照组的死亡细胞数均显著高于Sham组(P值均<0.001),且NXS治疗组的TUNEL阳性细胞数显著低于ICH对照组(P<0.01)。结论脑血疏口服液可能是通过抑制EMMPRIN的表达这一作用靶点,来减少ICH后的脑损伤面积、小胶质细胞的激活、神经元的变性死亡以及死亡脑细胞数,来发挥脑保护作用,从而改善脑出血后的脑损伤。