背景与目的 流行病调查资料显示，亚洲国家居民的乳腺癌、前列腺癌、结肠癌以及心血管疾病的发病率显著低于西方发达国家，从膳食因素与癌症的关系这一角度考虑，过去一直认为其主要原因是西方发达国家居民的膳食中总脂肪和饱和脂肪酸含量较高，而膳食纤维含量较低的缘故。但是由于没有什么令人信服的证据证明这种相关性，这几年关于这方面的研究日益淡化。然而，近年来又有研究者提出，大豆的高消费量才是亚洲居民这类疾病低发的主要原因。在亚洲，居民的人均大豆消费量是西方发达国家的20～50倍。1991年，在新加坡做的病例——对照实验发现，食用适量的大豆可以减少50％的绝经前妇女乳腺癌的发病率，同时动物实验也发现大豆蛋白可以减少化学诱变剂诱导的小鼠乳腺瘤的发生。这引起了学者对大豆抗癌研究的极大兴趣，并且，此类课题得到了美国国家癌症研究中心的资助。在随后的十年中，大量的实验研究资料表明，大豆中所包含的大豆异黄酮是大豆广泛生理作用的主要活性成分。 大豆中一共包含有十二种异黄酮类化合物，统称为大豆异黄酮(soybean isoflavones)，它主要以结合型糖甙的形式存在于大豆中，其中染料木苷(Genistin)和大豆苷(Daidzin)是含量最多的两种异黄酮，并且前者要稍多于后者。另外，还存在有少量的6-甲基大豆素(Glycitin)和这些结合型糖甙相对应的甙元：染料木黄酮(Genistein)、大豆苷原(Daidzein)、大豆黄素(Glycitein)以及其它微量 浙江大学2003届硕士毕业论文论文异黄酮。结合型糖贰在体外发酵或在体内肠道微生物作用下大部分转化成它们对应的贰元并主要以贰元的形式发挥其生物学活性。 目前，研究较多的是染料木黄酮m，又叫三羟异黄酮），除了具有雌激素和抗雌激素作用外，它还具有许多非雌激素相关作用，包括抑制酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶＊ hpJ）的活性，抑制特异性细胞周期、抑制血管增生和抗氧化等作用，并成为诱导肿瘤细胞凋亡的经典化合物。所有这些雌激素和非雌激素样的作用特性都与其抗肿瘤活性有关。除了对乳腺癌、前列腺癌，结肠癌、骨质疏松、心血管等疾病有防治作用以外，研究还发现它对胃癌、尿道癌、膀肤癌、皮肤癌、头颈癌、白血病、以及肾病等都有作用。资料报道其作用机制广泛而复杂，并且都没有定论。 大豆昔原山，又叫二羟异黄酮），大豆中另外一种主要异黄酮，也是一种弱雌激素，它没有抑制酪氨酸蛋白激酶和抑制top－11的活性，在结构上它与G十分相似，只是在母环5位上少了一个羟基。很多时候它都是作为G的没有活性的类似物，作为G的对比和G一道被当作工具研究机体有关酪氨酸蛋白激酶所涉及的机制。事实上，近些年来的研究发现，D同样具有广泛的生理活性，对骨质疏松的作用比G强。为了研究D对癌细胞的作用，以及比较D与G的作用区别，我们特地设计了本次实验：研究大豆昔原在体外对L。Vo细胞生长的影响，并测定了其抑制作用的最佳浓度及作用时间。通过流式细胞仪，观测其是否可以引起凋亡及阻滞细胞周期的方式，探讨其作用机理。本实验内容在国内外的文献检索中未见类似报道。 材料和方法 1．细胞培养：LOVo细胞常规培养于含 10％的小牛血清的RPMI—1640培养液中，5％CO＊7℃贴壁培养 48h后弱光下换液一次，取对数生长期的细胞进行实验，用0．25％的胰蛋白酶消化传代收集细胞，调整细胞浓度为IXIO勺ml。2．药物配制：用二甲基亚矾（DMSO）溶解大豆昔原，加入到培养液中制成终浓度为0人卜M、lpM、SPM、10卜M、50卜M、100卜M含药培养液，调整二甲基亚矾的体积百‘分比使其浓度始终为 l％0（V／V）。3．细胞增殖测定：在细胞 2 浙江大学2003届硕土毕业论义论文接种后24卜去除培养液，加入含有不同浓度大豆苦原的培养液20O叶共分为8组：第一组为不含大豆昔原及 DMSO的空白对照，第二组为含有 l％ODMSO的不含大豆昔原培养液，3～8组分别为含大豆昔原 0二～100pM的培养液，分别在药物处理后二天、3天。4天、6天后，用快速翻转法除去培养液，加入浓度为 Zmg／ml的MTT30叫孔，培养4小时后加入DMSO 150W孔，室温下在微孔扳震荡器上震荡 10min，待成色产物溶解后，用酶标仪测 A值（入巧，630urn双波长测定），结果用t检验。4．测定细胞内碱性磷酸酶活性：细胞常规用胰酶消化后以1X 10‘／ml细胞量接种到 12孔细胞板中培养 24小时，按细胞增殖测定中所用方法加入不同浓度的大豆昔原的培养基2、4、6天后，用0．125％的胰蛋白酶消化成单细胞悬液，低速离心后用0．smIO．25％脱氧胆酸钠溶解细胞，置－70aC低温冰箱中备测。用RA－50型全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶ALP活性及细胞总蛋白浓度。ALP比活性OU／mg）－ALP／总蛋白量。5。细胞周期测定：在细胞培养后加入大豆苦原（方法同 3人细胞用胰酶消化