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葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,EC 1.1.3.4,GOD)是一种需氧脱氢酶,在有氧条件下,能够以分子氧为电子受体,将葡萄糖氧化为葡萄糖酸和过氧化氢。GOD广泛用于食品及饲料添加剂、防腐剂、生物传感器及葡萄糖酸生产等。但目前商品GOD产量低且热稳定性差,限制了GOD大规模的工业应用。本研究从重组表达Penicillium notatum F4葡萄糖氧化酶基因godp的毕赤酵母菌株PP-GOD出发,利用基因工程手段对重组GOD毕赤酵母菌株进行改良,提高其分泌表达GOD的能力;另一方面,利用计算机辅助理性设计对GOD蛋白进行分子改良,以提高其热稳定性。主要研究结果如下:1.在重组GOD毕赤酵母菌株中,共表达来源于Pichia pastoris的SEC61复合体编码基因SEC61、未折叠蛋白响应机制(UPR)转录激活因子Hac1p的编码基因HAC1以及来源于Saccharomycescerevisiae的折叠酶PDI、ERO1基因,研究各种辅助因子对GOD分泌表达的影响。结果表明,共表达SEC61对GOD表达影响最为显著,培养基中GOD活力为原始菌株PP-GOD的3.24倍。共表达PDI、ERO1均有助于提高GOD的表达量,培养基中GOD活力分别为原始菌株PP-GOD的1.95倍和1.32倍。共表达HAC1也有效提高了GOD的表达量,培养基中GOD活力为原始菌株PP-GOD的1.38倍。2.通过同源建模和分子动力学模拟构建了P.notatum F4来源GODp的蛋白三维结构模型,从稳定蛋白质结构入手理性选择9个氨基酸位点,以期提高蛋白热稳定性。对选定的9个突变位点构建毕赤酵母饱和突变体库。筛选结果表明,其中7个突变体D408W、D408T、D408K、D408C、E476T、E476K和S100A的热稳定性得到提高。其中S100A和D408W的热稳定性有明显的提高,相比野生型,两个突变体在55℃的半衰期分别提高了5.13倍和4.41倍,T_m值分别提高了4.4℃和1.2℃。本研究从葡萄糖氧化酶应用领域最突出的问题入手,提高了葡萄糖氧化酶的热稳定性和分泌表达效率,进而有效降低了酶制剂的生产和使用成本,这种新型葡萄糖氧化酶制剂将进一步扩大该酶在食品以及饲料行业的应用,具有良好的理论和实际应用前景。