第一部分母代运动和饮食干预显著改善生命早期不良营养编程的子代成年期糖脂代谢异常[研究目的]目前全球糖尿病患病率迅猛增长,但其发病机制尚不完全明确。我国糖尿病等代谢异常的医疗资源多分布在疾病已形成期或出现并发症后,对于疾病的早期识别和早期干预迫在眉睫。近年来越来越多的研究显示生命早期不良营养环境将增加成年期患糖尿病、肥胖等慢性疾病的风险。本研究拟通过动物模型探究母代运动和饮食干预是否可改善甚至逆转生命早期营养过剩导致的子代成年期代谢异常。[研究方法]我们构建了 2个独立的小鼠队列来验证“母代运动和饮食干预可有效改善子代成年期糖脂代谢”的科学假说:1.母代运动干预小鼠模型:C57BL/6J雌性小鼠按体重随机分为三组:正常饮食组、高脂饮食组、高脂饮食运动组。运动干预方式为自主跑轮。其中运动干预时间为孕前3周和孕期,饮食干预时间为孕前3周、孕期和哺乳期。2.母代染料木黄酮饮食干预小鼠模型:C57BL/6J雌性小鼠随机分为三组:正常饮食组、高脂饮食组、高脂饮食添加染料木黄酮组（0.6g/kg体重）,干预时间为孕前3周、孕期和哺乳期。两个小鼠模型中雌性小鼠均与同年龄正常饮食自由活动状态的C57BL/6J雄鼠合笼交配,子鼠断乳后均给予正常饮食至24周龄。监测母鼠和子鼠的体重、出生体重、脂肪含量、摄食量、运动量并进行葡萄糖耐量试验,母鼠哺乳期结束后和24周龄子鼠处死取外周血,分离获取血清,进行胰岛素和血脂谱检测,分析母代运动和饮食干预对子代成年期代谢的影响。[研究结果]1.孕前3周、孕期和哺乳期高脂饮食使母鼠血糖、空腹血清胰岛素水平、血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显著高于正常饮食组。而母代运动干预对自身糖脂代谢改善有限,仅有降低HOMA-IR指数的趋势。然而,母代高脂饮食导致子鼠出现追赶生长,随着年龄增长有逐渐发生肥胖的趋势,同时糖耐量试验曲线下面积显著增大,至24周龄时皮下和内脏脂肪组织显著增多,出现胰岛素抵抗和高胆固醇、高甘油三酯血症。而母代运动干预可防止子代发生肥胖,同时降低血糖、减少糖耐量试验曲线下面积,改善胰岛素抵抗和血脂紊乱,降低脂肪组织含量。2.在母代染料木黄酮饮食干预小鼠模型中,我们同样发现母鼠围产期9周高脂饮食使自身和子鼠都发生糖代谢异常和血脂紊乱,而染料木黄酮干预有降低母鼠血清空腹胰岛素水平的趋势,同时可显著降低其孕期空腹血糖水平。对于子鼠,母代染料木黄酮饮食干预可阻止其出生后追赶生长,同时显著降低糖耐量试验曲线下面积,减少24周龄时皮下和内脏脂肪含量,改善胰岛素抵抗和血脂紊乱。[研究结论]母代孕前期3周和孕期的自主跑轮运动干预可显著改善生命早期高脂饮食导致的子代易感肥胖和糖脂代谢紊乱;母代孕前期3周、孕期和哺乳期的生物活性成分染料木黄酮饮食干预同样降低了成年子代的体脂含量,改善了生命早期高脂饮食导致的子代糖代谢异常、胰岛素敏感性降低及血脂谱紊乱。因此,对生命早期不良环境进行运动和饮食干预可有效改善甚至逆转不良“代谢记忆”,及时预防和阻断成年期糖脂代谢异常的发生,使从根本上在生命早期水平阻断未来糖脂代谢异常的发生发展成为可能。第二部分肠道菌群在介导母代干预调控子代成年期糖脂代谢中的作用[研究目的]肠道菌群在代谢健康中发挥着重要的作用。近年来越来越多的研究提示肠道菌群可能在生命早期不良发育环境增加成年期代谢异常风险中扮演了重要的角色,可能是破译“代谢记忆”的关键机制之一。鉴于运动和染料木黄酮均可调控肠道菌群,我们拟探究肠道菌群是否在介导母代运动和饮食干预中发挥了重要作用。[研究方法]在第一部分建立的母代运动干预小鼠模型和母代染料木黄酮饮食干预动物模型基础上,获取哺乳期结束后母鼠以及成年24周龄子鼠的盲肠内容物。肠道微生物16s rRNA扩增子测序采用Illumina Hiseq 2500 PE250。应用生物信息学对测序获得的reads进行OTU分析、物种注释、物种差异分析及样本多样性分析,并将差异物种与代谢通路相关联,使用Spearman相关性分析将差异菌属与糖脂代谢指标进行分析。[研究结果]1.正常饮食组、高脂饮食组和高脂饮食运动组三组间母鼠菌群β多样性分析显示显著分离。同时运动干预使母鼠肠道中Alloprevotella、Barnesiella、Odoribacter和Saccharibacteriagenerancertaesedis菌属丰度显著增加。对于成年子鼠,β多样性分析显示三组子代菌群显著分离。母鼠围产期高脂饮食使子代在属水平显著富集Lachnospiraceaincertae sedis和Anaeroplasma菌,而母代运动显著增加成年子代Helicobacter、Odoribacter和 Clostridium/mXIVb丰度。Spearman 相关性分析显示母代高脂饮食使子鼠显著富集的Anaeroplasma菌与糖耐量试验糖负荷后血糖以及曲线下面积、空腹胰岛素、HOMA-IR指数和总胆固醇水平呈显著正相关,同时Lachnospiraceaincertaesedis菌与血糖和游离脂肪酸水平也呈现正相关。与此相反,母代运动干预增加的Helicobacter和Odoribacter菌均与成年子鼠的血糖、胰岛素和血脂呈现显著负相关。2.在染料木黄酮饮食干预小鼠队列中,β多样性分析显示三组母鼠菌群显著分离。在属水平,高脂饮食显著富集Mucispirillum菌,染料木黄酮饮食干预后该菌丰度明显恢复。而 Barnesiella、Clostridium XIVa、Clostridium IV、Eubacterium和Bifidobacterium在高脂饮食后丰度显著低于正常组,染料木黄酮饮食干预可恢复Allobaculum、Barnesiella、Clostridium XIVa和Eubacterium的丰度。对成年子鼠,β多样性分析显示母代高脂饮食和染料木黄酮饮食干预后成年子代肠道菌群显著分离。在属水平,母代高脂饮食使子代肠道中双歧杆菌属丰度显著降低。而Erysipelotrichaceae incertae sedis菌属在母代摄入染料木黄酮的子代肠道中显著富集。Spearman相关性分析显示双歧杆菌属以及母代染料木黄酮饮食显著富集的子代Erysipelotrichaceaencertaesedis菌与成年子代的血清空腹胰岛素、血脂以及白色脂肪含量呈现显著负相关。[研究结论]1.母代高脂饮食和运动干预使母体和成年子鼠的肠道菌群显著分离,组成和结构发生明显改变,改变的菌群与糖脂代谢指标呈现显著相关性。其中肠道有害菌Lachnospiraceaincertae sedis的减少和产短链脂肪酸菌的显著富集,可能是介导母代运动跨代调控代谢的关键因素。2.母代染料木黄酮饮食摄入也调节了自身和子代的肠道菌群,改变的菌群与改善的代谢指标之间具有明确的相关性。其中肠道产短链脂肪酸（主要是丁酸）菌以及Erysipelotrichaceae incertae sedis的显著富集、有害菌属 Mucispirillum的减少,可能在母代染料木黄酮饮食干预改善子代代谢健康中发挥了重要作用。此外,双歧杆菌菌属与母体和子代的代谢改善均相关。本研究原创性地探究了肠道菌群在介导运动和染料木黄酮摄入跨代调控代谢中的作用,从肠道菌群视角为生命早期预防和阻止代谢异常的发生和发展提供了一些理论证据和可能的干预靶点,为我国代谢性疾病的防治窗口前移奠定了基础。第三部分表观遗传修饰可能是解释母代运动和饮食干预调控成年期子代代谢的重要机制[研究目的]表观遗传学是介导基因和环境互作的重要机制,在代谢调控中发挥重要作用。随着高通量测序技术的快速发展,近期证据显示miRNAs可能是介导生命早期不良环境编程代谢的关键机制之一。但目前尚无研究探究母代运动和饮食干预对子代成年期表观遗传学修饰的影响。本研究旨在探究母代运动和饮食干预对子代成年期肝脏代谢的编程效应及miRNAs是否在其中发挥了重要的调控作用。[研究方法]在第一部分建立的母代运动和染料木黄酮饮食干预的跨代动物模型基础上,我们进一步获取了 24周龄成年子鼠的肝脏组织,进行RNA提取和转录组学、miRNAs高通量测序,并对测序数据进行生物信息学分析,最后采用qRT-PCR方法对测序结果进行验证。[研究结果]1.与正常饮食组相比,母代高脂饮食导致成年子代肝脏195个基因显著上调,158个显著下调;而与高脂饮食组子代相比,母代运动显著上调285个基因,下调324个基因。其中母代高脂饮食显著上调而运动干预显著下调的基因共有122个,KEGG通路富集分析显示主要富集在与糖代谢和氨基酸代谢密切相关的信号通路上;而母代高脂饮食显著下调而运动干预显著上调的基因共有89个,主要富集在PPAR信号通路、不饱和脂肪酸合成和脂肪酸代谢信号通路上。2.与正常对照组相比,母代高脂饮食的子代肝脏共有20个差异的miRNAs;而与高脂饮食组子代相比,母代运动干预使13个miRNAs下调,7个miRNAs显著上调。两组比较中有3个共同差异的miRNAs,分别为miR-204-5p、miR-10b-5p、miR-139-3p,均在高脂饮食组子代显著下调,而母代运动干预上调其表达。其靶基因参与了表观遗传调控以及SREBF调控的胆固醇合成。3.与正常饮食组相比,母代高脂饮食导致的成年子代肝脏差异基因显著富集在固醇类激素生物合成、初级胆汁酸生物合成、TGFβ信号通路以及糖尿病并发症相关信号通路上。与高脂饮食组相比,母代染料木黄酮摄入显著调控了 49个差异基因,其中32个上调,17个下调,这些基因显著富集在与糖代谢和氨基酸代谢密切相关的信号通路上。其中共有10个母代染料木黄酮干预逆转的基因,这些基因主要富集在与免疫调控和炎症反应等密切相关的信号通路上。4.与正常对照组相比,母代高脂饮食的子代肝脏共有20个差异的miRNAs。而与高脂饮食组子代相比,母代染料木黄酮饮食干预使27个miRNAs水平改变,包括17个显著下调,10个上调。两组比较中共有3个共同差异的miRNAs,分别为miR-12206-5p、miR-200a-5p、miR-21a-3p,均在母代高脂饮食子代中显著下调,而母代染料木黄酮饮食干预可显著上调其表达,其靶基因参与了糖脂和氨基酸代谢调控等相关信号通路。[研究结论]1.母代运动干预在分子水平也显著调控了子代成年期肝脏代谢,逆转母鼠高脂饮食调控的基因,这些基因富集在糖脂代谢相关重要信号通路上。同时显著逆转成年期肝脏组织3个miRNAs表达水平,其靶基因进一步参与调控胆固醇合成代谢以及表观遗传学修饰,可能在介导运动跨代代谢调控中发挥了重要作用。2.母代染料木黄酮饮食干预不仅在表型方面,在分子水平也显著调控子代成年期肝脏组织代谢,逆转高脂饮食改变的基因,这些基因显著富集在免疫调控相关信号通路上。表观遗传调控机制研究显示母代染料木黄酮饮食干预可上调其高脂饮食下调的子代成年肝脏组织 miRNAs 水平,包括 miR-12206-5p、miR-200a-5p、miR-21a-3p,这些miRNAs参与了糖脂代谢调控和炎症反应,可能是介导母代染料木黄酮饮食干预编程子代成年期代谢的关键分子之一。总之,本研究开创性地探究了表观遗传调控在介导母代运动和染料木黄酮饮食干预编程子代成年期代谢中的作用,为不良“代谢记忆”的逆转增添了新的内容,为生命早期糖脂代谢异常的预警和防治提供理论依据。