一、研究背景心血管疾病仍然是引起人类死亡的主要疾病之一。冠心病的发生是由于内皮细胞损伤,血管平滑肌异常增殖,导致血管狭窄,引起心肌缺血。衰老是导致心血管疾病进展的最大危险因素之一。与年龄相关的心血管相关病理生理学的分子机制,目前尚不清楚。与衰老相关的病理生理过程包括血管的平滑肌表型转换、心肌缺血后的心功能改变。这些病理生理活动的改变与许多衰老相关基因的异常表达密切相关。PSEN1突变是家族性老年痴呆的核心基因之一。PSEN1是一种多次跨膜蛋白,广泛表达在各种不同组织中,我们在本课题研究发现PSEN1在脑和心脏中高表达。有研究显示PSEN1突变与遗传相关扩张型心肌病相关。我们课题组也曾报道PSEN1基因敲除能够导致小鼠心脏发育异常,包括室间隔缺损、右心室双出口和肺动脉狭窄等问题;另外我们课题组还发现PSEN1基因敲除能够引起心脏舒张异常。虽然PSEN1在心脏中发挥重要作用,但PSEN1在衰老过程中的心血管功能仍有待于进一步研究。二、实验模型与方法1.RNA的提取样品置于1ml Trizol中,加入200μl的三氯甲烷,震荡,静置5 min,低温离心机中12000 rpm离心10 min。吸取上清到新的EP管中,加入400μl异丙醇,上下颠倒,混匀后,置于-20度冰箱,沉淀RNA。超速离心机12000 rpm,4度离心15 min,弃上清,管底可见RNA白色沉淀斑块。加入75%乙醇1 ml,8000 rpm,4度离心10min,弃上清。待酒精挥发彻底后,RNA斑块由白色变为透明,加入无RNA酶的水40μl,吹打溶解RNA。取1μl RNA进行浓度测定。2.实时荧光定量PCRRNA样品经反转录酶反转,反转条件:42度15 min;95度5 min;16度保持。反转录产物用dd H2O稀释10倍后,作为荧光定量PCR的c DNA模板。通过荧光信号获得目的基因的CT值,以GAPDH或U6为内参,通过2ΔΔCT的方法计算目的基因的相对表达量。3.细胞系培养细胞系P19,AC16,H9C2,293T,Hela培养于含10%胎牛血清和100U/ml青链霉素的DMEM培养基中。Raw264.7培养于含10%胎牛血清和100U/ml青链霉素的RMPI-1640培养基中。PASMC和Ao SMC培养于含2%胎牛血清和100U/ml青链霉素的SMCM-生长因子培养基中。HCAEC和HUVEC培养于含5%胎牛血清和100 U/ml青链霉素的ECM-生长因子培养基中。4.原代心肌细胞、心肌成纤维细胞的分离培养出生3天的SD乳鼠,取出心室,将心室剪成1 mm~3左右。用0.1%的胶原酶,4℃消化组织块,过夜。次日,移液器吹打组织块,以1000 rpm离心15 min。差速贴壁2小时,分离心肌成纤维细胞;上清细胞计数后,以3×10~5-5×10~5/ml密度接种于6孔板中。继续培养24h后,培养液换成含10%小牛血清（含0.1 m M Brd U）的DMEM培液,来抑制掺杂的少量成纤维细胞的增殖,继续培养48小时后,培养液换成不含血清DMEM液。5.平滑肌表型转化模型（1）PASMC和Ao SMC细胞培养于SMCM全培液中。PASMC和Ao SMC细胞无血清-无生长因子的SMCM培养基、正常培养24小时,构建平滑肌细胞血清剥夺模型。（2）PASMC和Ao SMC细胞接种后,换成无血清-无生长因子的SMCM培养基,饥饿处理12小时后,一半细胞不做处理,另一半细胞加入20ng/ml PDGFbb,继续培养24小时后,构建平滑肌细胞表型转化模型。6.内皮细胞增殖、损伤模型（1）内皮细胞缺氧模型:HCAEC细胞接种到3个6孔板后,两个6孔板置于1%O2,5%CO2细胞培养箱中进行培养,分别在低氧处理9小时和24小时,收取RNA。常氧培养的HCAEC在24小时时间点收取RNA。（2）内皮细胞增殖模型:HUVEC细胞接种到6孔板中,密度长至70%,4个孔换成无血清-无生长因子的ECM培养基,12小时后,2个孔加入VEGF、2个孔加入FGF,继续处理24小时,收取蛋白。（3）内皮细胞损伤模型:HCAEC细胞接种到细胞培养板后,无血清-无生长因子处理12小时,分别给予同型半胱氨酸、ox LDL处理24小时,收取RNA,用于后续分析。7.人心肌样本的采集,及RNA和蛋白抽提本课题所用的16例心脏样本均来自2012年至2018年间在我院进行器官移植的患者,其中7例ICM样本来自心脏移植病人,术后废弃的衰竭心脏。9例正常心肌样本,来源于肝移植或其它器官移植的供体捐献者。所有样本的获取均获得患者及家属的知情同意。临床手术中获取新鲜标本采取液氮冻存后,置于-80度冰箱保存。本课题所涉及临床标本均已获得海军军医大学伦理委员会审批。8.Western blot蛋白样品经定量后,加入SDS裂解液,样品经超声处理,沸水浴煮5 min。样品在冰上静置2分钟后,用于后续Western blot检测。蛋白样品按每孔40μg的量进行上样,100 V凝胶电泳10 min后,140 V电泳到溴芬兰跑至胶底。电泳结束后,100 V转膜2 h。将膜用5%牛奶封闭2 h后,置于4℃冰箱的摇床上,与TBST稀释的一抗孵育过夜。次日,将膜用TBST在室温下清洗4次,每次10 min。然后将膜置于用5%牛奶稀释的二抗中,室温孵育2h,室温下将膜用TBST清洗4次,每次8 min。ECL显影,获得蛋白表达信号。9.PSEN1平滑肌和心肌特异敲除小鼠的构建通过将PSEN1的Flox P小鼠与Sma22-Cre小鼠进行杂交,获得心肌和平滑肌PSEN1敲除小鼠。10.小鼠组织学染色和超微结构观察（1）组织学染色:小鼠组织固定于4%多聚甲醛备用。组织经水冲洗,浓度梯度乙醇依次脱水,二甲苯去除酒精,使组织块透明;浸蜡2-3h,将浸透好的样本切面向下放入含有石蜡的包埋器内,静置。石蜡包埋的组织块切片,切好的蜡带,温水中展平,载玻片捞片,常规HE染色。（2）超微结构分析:取1年龄小鼠的心脏,切成1 mm~3小块,4%多聚甲醛固定,常规电镜包埋、切片、醋酸铀-枸橼酸铅染色后,进行超微结构观察。11.颈动脉插管检测小鼠的血压小鼠经异氟烷麻醉后,分离颈外静脉和颈总动脉,进行颈总动脉插管术,压力传感器和生物信号转化系统依次接通。把颈总动脉插管远心端的小塑料塞拔下（动脉夹仍然夹住）与传感器（内事先灌满生理盐水和肝素）接口相连,轻轻打开动脉夹。直接通过压力传感器将血压波动转化成电变化。放大器放大后经模数转换器通过微机进行分析处理。显示屏可以观测血压波动变化。每只小鼠记录10分钟血压,计算收缩压和舒张压。12.颈动脉套管导致血管狭窄模型和股动脉内膜损伤模型（1）颈动脉套管导致血管狭窄模型:小鼠经异氟烷麻醉后,充分暴露颈总动脉,将长度为1cm的微型塑料软导管纵向剖开。将套管缺口处套入颈总动脉,7-0丝线固定套管,两侧均先不扎紧,待两端固定90%后再扎紧。缝合皮肤伤口。常规饲养2周,取材,固定,组织学观察。假手术侧,只分离颈总动脉,但不放置塑料软导管。（2）股动脉内膜损伤模型:小鼠经异氟烷麻醉后,分离股动脉,结扎远心端。将导丝放入股动脉,反复抽拉10次。缝合伤口,2周后,取材,进行组织学观察。13.基因芯片检测m RNA的表达及功能富集分析小鼠的主动脉中提取RNA。混样后进行m RNA微阵列分析。以差异倍数超过2倍,作为筛选条件,确定表达异常的基因。通过Cytoscape的一系列插件分析PSEN1敲除后异常表达的基因。使用Cyto Hubba插件的默认参数获取hub基因;使用Cytoscape中的Clue GO插件进行基因本体论和KEGG分析。14.成年小鼠的心功能检测成年11个月的PSEN1心脏和血管平滑肌特异敲除小鼠,及野生型小鼠各12只。小鼠经麻醉机的异氟烷麻醉后,经Visual Sonics超声系统检测小鼠射血分数,缩短分数,左室收缩期末室腔容积、舒张期末室腔容积等指标。15.利用重组腺病毒在条敲小鼠中过表达ATP2a2PCR扩增人ATP2a2,克隆到p Shutter-CMV质粒。按照Ad Easy TM XL腺病毒载体系统说明书（目录#240010）建立重组腺病毒。腺病毒由Vira Trap TM腺病毒纯化试剂盒（Biomiga,Catalog#V1160-02）纯化。为测定病毒的最佳滴度,估计pfu/ml。16.单个心肌细胞的酶解法分离及心肌细胞Ca2+的荧光检测改良的Langendorff灌流系统进行心脏逆行灌注不含Ca2+的台式液,随后灌注胶原酶II型溶液（内含牛血清白蛋白）约8-10分钟。心室肌在改良KB液中切成小块,轻轻摇动以分离细胞。在徕卡TCS SP2共聚焦显微镜下进行Ca2+测量。荧光Ca2+指示剂Fluo-3/AM检测胞内Ca2+,Fluo-5N/AM用于SR Ca2+检测。17.统计学分析数据以均数±标准差的方法表示。对于符合正态分布的数据,实验组与对照组进行t检验。P<0.05为显著性差异。三、实验结果（一）膜镶嵌蛋白PSEN1在心血管疾病中的表达异常1.PSEN1在组织和细胞系中的表达通过RT-PCR检测了PSEN1的m RNA在各个器官中的表达水平。结果显示PSEN1在所检测13个组织中广泛表达。PSEN1在心血管相关细胞系或常用工具细胞中均有表达,在内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和心肌成纤维细胞中,PSEN1都有多个条带,主要是65k D左右的全长序列,35k D左右的N-端序列;20k D左右的C端序列。2.PSEN1在心血管疾病模型中的表达通过PDGFbb构建平滑肌细胞由收缩型向分泌型转化模型,检测发现,PDGFbb刺激能够引起PSEN1表达降低;在血清剥夺抑制平滑肌细胞增殖模型中,检测发现,PSEN1的m RNA表达在血清剥夺后明显升高。通过缺氧孵箱构建了内皮细胞缺氧模型,检测发现PSEN1的m RNA在缺氧处理的内皮细胞中表达降低。通过VEGF和FGF构建了内皮细胞增殖模型,检测显示VEGF和FGF处理内皮细胞不能改变PSEN1的蛋白表达水平。通过同型半胱氨酸和ox LDL构建了内皮细胞损伤模型,检测显示PSEN1的m RNA水平在两种模型中均没有表达差异。在心肌中检测显示在人缺血诱发的心衰样本中,PSEN1的m RNA和蛋白表达水平明显降低。PSEN1的m RNA下调至约为正常心脏的60%,而PSEN1的蛋白表达水平仅为正常心脏的50%。（二）心肌和平滑肌特异PSEN1敲除小鼠的建立与验证1.Sma22-Cre在血管平滑肌和心肌中能够切除Flox P的STOP位点通过Sma22-Cre小鼠与EGFP的Flox P-STOP codon小鼠杂交,对子代鼠进行切片观察,显示EGFP主要在心肌细胞和平滑肌细胞中。通过Exon4的Flox P小鼠与Sma22-Cre小鼠进行杂交,获得了PSEN1的平滑肌和心肌特异敲除小鼠。2.Sma22-Cre-PSEN1 Flox P小鼠在血管平滑肌和心肌中的敲除验证Western Blot检测PSEN1的蛋白表达,结果显示,在Sma22-Cre-PSEN1 Flox P纯合子小鼠中,PSEN1的蛋白表达量在血管和心脏明显降低。3.血管平滑肌和心肌PSEN1基因敲除小鼠的生存分析在11个月大的时候,WT和PSEN1-KO组小鼠的生存曲线显示,Sm22a-PSEN1-KO导致小鼠,尤其是高龄小鼠的自发性死亡。（三）膜镶嵌蛋白PSEN1在血管平滑肌细胞中功能与机制1.PSEN1敲除血管的组织学和血压出现异常通过Sma22-Cre-PSEN1 Flox P-EGFP stop Flox P小鼠的组织切片进行荧光观察,发现8周龄Sma22-Cre敲除平滑肌细胞中的PSEN1后,弹力纤维排列紊乱。通过动脉导管检测小鼠血压,发现PSEN1敲除后,小鼠的收缩压和舒张压都出现升高。2.PSEN1敲除在衰老过程中引起血管炎症提取血管RNA,通过荧光定量PCR检测发现,在8周龄的野生鼠和敲除鼠的血管间,Calp1,Calp2,Calp3,Myh11,ACTA2,ITGB没有明显的表达差异;MCP1和CRP没有明显的表达差异。通过Western Blot检测显示CD45、Ly6C和VCAM1的蛋白在8周龄的野生鼠和敲除鼠的血管间没有明显的表达差异。提取8月龄小鼠的血管RNA,定量PCR检测显示ACTA2和Myh11在PSEN1敲除小鼠中表达升高。通过Western blot检测显示CD45、Ly6C和VCAM1在8月龄PSEN1敲除小鼠的血管中明显升高。检测发现PSEN1敲除促进11月龄小鼠血管中VCAM1、Ly6C和BCL2的表达升高。3.PSEN1敲除在血管损伤模型中的功能构建血管损伤模型,比较了动脉血管的狭窄程度,结果显示PSEN1敲除能够明显促进动脉缩窄所致的平滑肌重塑过程。通过导丝损伤模型建立了股动脉血管重塑模型,发现12周龄小鼠在PSEN1敲除组的血管重塑明显高于野生型对照组。4.转录组水平探讨PSEN1敲除对基因表达的影响通过RNA芯片检测血管中异常表达的基因。通过Cytoscape对异常表达的基因进行功能富集分析,发现基因富集在Toll样受体4,TCR复合体互作肽抗原递逞MHC,正向调控淋巴细胞凋亡过程,炎症相关的信号通路;很多基因也富集在肌肉收缩方面。这些异常表达的基因与炎症的发生和平滑肌细胞在炎症环境下增殖密切相关。5.血管中PSEN1敲除对信号通路的影响检测了ERK和AKT信号通路,发现ERK在老年鼠中基础表达量和磷酸化水平明显升高,PSEN1敲除能够促进ERK的磷酸化。检测AKT的表达水平和磷酸化水平,显示AKT的磷酸化水平在PSEN1敲除鼠中明显升高。检测显示在年轻鼠中,PSEN1敲除并不影响TEAD4的表达,明显降低YAP1的表达;在老年鼠中,PSEN1敲除明显升高TEAD4的表达,而不影响YAP1的表达。通过定量PCR检测YAP1-TEAD4下游分子,显示在PSEN1敲除鼠的血管中CTGF和CRY61的表达明显升高。检测显示SMAD2的蛋白表达水平和磷酸化水平明显升高。检测显示,与青年小鼠相比,老年小鼠血管中CTNNB的表达水平明显降低。在青年小鼠中,PSEN1的敲除不影响CTNNB和Axin1的表达水平,而在老年鼠中PSEN1的敲除促进了CTNNB和Axin1的表达。检测显示Her2和HES1的表达不受PSEN1的影响,而Her1的表达水平明显升高。（四）PSEN1在心肌细胞中的功能与机制1.心肌PSEN1基因敲除对老年鼠心功能的影响对12只WT和12只11月龄的Sm22a-PSEN1-KO小鼠的超声心动图结果显示,与WT组相比,Sm22a-PSEN1-KO组的射血分数（ejection fraction）和左室短轴缩短率（fractional shortening）显著降低。Sm22a-PSEN1-KO组左心室舒张末内径（LVID-d）和左心室收缩末内径（LVID-s）均显著升高。处死小鼠后,11月龄时的PSEN1-KO小鼠的心脏重量/体重比明显低于同龄的WT小鼠。比较了WT小鼠和Sm22a-PSEN1-KO小鼠心脏组织的超微结构。Sm22a-PSEN1-KO小鼠心肌细胞肌原纤维减少,肌节Z线增宽,肌节长度增加。通过q RT-PCR检测心衰标记分子显示,与WT小鼠相比,Sm22a-PSEN1-KO小鼠心脏中ANP和BNP表达显著上调。2.Sma22-PSEN1敲除小鼠的心脏异常表达的基因分析采用芯片技术筛选3个月大的WT和Sm22a-PSEN1-KO小鼠心脏中的异常基因。共检测到321个异常调控基因（差异倍数>2）,包括143个上调基因和178个下调基因。这些基因用蛋白相互作用的String数据库进行分析。我们通过Cyto Hubba插件,利用Cytoscape软件的默认参数获得至关重要的节点（nodes）,排名前三位的节点（TTN、Mybpc3和Nppa）用于分析蛋白-蛋白相互作用的网络拓扑。Cytoscape软件的Clue GO分析显示,异常调控的基因在横纹肌细胞发育、肌肉收缩系统、胚胎心管形态生发、toll样受体结合和负调控骨吸收这些功能中高度富集。KEGG结果分析显示,基因富集的通路还与扩张型心肌病、Apelin信号通路、心肌收缩、致心律失常的右心室心肌病、心肌细胞中肾上腺素相关信号通路、细胞粘附分子、调节脂肪细胞的脂解作用、抗原处理和递呈、甲状腺激素合成和原发性免疫缺陷这些功能相关。3.心肌细胞中Sm22a-PSEN1-KO增加Ry R2表达,减少了ATP2a2的表达与WT小鼠相比,Sm22a-PSEN1-KO小鼠心肌细胞中兰尼碱受体2（Ry R2）和电压依赖性L型钙通道的α-1c亚基（Cacna1c）表达上调。通过q RT-PCR证实了Sm22a-PSEN1-KO心脏中Ry R2和Cacna1c的上调。Western blot进一步证实Sm22a-PSEN1-KO心脏中Ry R2的上调;ATP酶肌浆/内质网Ca2+转运2（SERCA2,ATP2a2）显著下调。4.过表达ATP2a2改善PSEN1-KO衰老小鼠的心功能重组腺病毒在PSEN1-KO衰老小鼠中过表达ATP2a2。每组5只小鼠均成功转染了Ad-CTL或Ad-ATP2a2。Western blot检测各组2只小鼠ATP2a2的表达情况。三周后超声心动图检查心功能,显示EF、FS百分比明显升高,与转染Ad-CTL的小鼠相比,转染Ad-ATP2a2的小鼠LVIDd和LVIDs明显下降。通过Fluo-5N/AM测定SR Ca2+浓度。与Ad-CTL相比,过表达ATP2a2显著增加了SR内Ca2+浓度。与此相一致地,转染Ad-ATP2a2下调了PSEN1-KO衰老小鼠的ANP和BNP m RNA水平。四、结论1.PSEN1在组织中广泛表达,在平滑肌细胞、内皮细胞、心肌成纤维细胞和心肌细胞中有较高表达水平。2.在PDGFbb构建平滑肌细胞由收缩型向分泌型转化模型中,PSEN1表达降低;在血清剥夺抑制平滑肌细胞增殖抑制模型中,PSEN1的m RNAs表达在血清剥夺后明显升高。PSEN1敲除后,小鼠的收缩压和舒张压都出现升高。PSEN1敲除在衰老过程中引起血管炎症。PSEN1敲除在血管损伤模型中发挥重要作用;PSEN1敲除能够明显促进动脉缩窄所致的平滑肌重塑过程。通过导丝损伤模型建立了股动脉血管重塑模型,发现12周龄小鼠在PSEN1敲除组的血管重塑明显高于野生型对照组。血管中PSEN1敲除对信号通路的影响,例如:MAPK-ERK信号通路、PI3K-AKT信号通路、YAP1-TEAD4信号通路、TGF-b-SMAD信号通路和Wnt-CTNNB信号通路等。3.在心肌中检测显示在人缺血诱发的心衰样本中,PSEN1的m RNA和蛋白表达水平明显降低。PSEN1条件性敲除后导致年龄依赖的心功能降低,导致ANP和BNP表达上调;导致许多基因异常表达,这些基因富集在横纹肌细胞发育、肌肉系统过程、胚胎心管形态生发、toll样受体结合和负调控骨吸收等方面,其中Ry R2表达明显升高,而ATP2a2表达明显减少;过表达ATP2a2能够改善PSEN1-KO衰老小鼠的心功能和SR内Ca2+浓度。