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产酶溶杆菌属黄单胞科,溶杆菌属,是一种在环境中广泛存在的新型植物病害生防细菌。而HSAF(Heat-Stable Antifungal Factor)是其产生的一种小分子抗菌物质,其能够对多种真菌和卵菌产生抑制作用,在生物防治中发挥着重要作用,是一种结构和作用方式全新的广谱抗真菌、卵菌活性物质。生产无农药残留、无病虫危害的农业产品一直是促进人类自身健康和保护生态环境的重要途径,也是生物防治药物研究领域的主要目标。而HSAF作为一种环境友好型杀菌剂,具有开发为新型生物源农药的巨大潜力。然而现阶段HSAF的产量太低,无法实现工业化大规模生产,一定程度上制约了其在病害防治中的广泛应用和推广。因此获得HSAF高产菌株,提高HSAF产量是当前亟需解决的问题。本研究以HSAF为研究对象,以产酶溶杆菌OH11为出发菌株,采用三种方法进行HSAF高产菌株的选育。通过紫外诱变、HSAF负调控基因的敲除、HSAF生物合成基因及其正调控基因的启动子改造,构建了多个不同的突变菌株,并对其HSAF产量进行评估。通过紫外诱变,筛选到3株HSAF高产菌株,其HSAF产量与野生型相比分别提高了 36%、33%和25%,但是遗传稳定性实验表明,其遗传性状并不稳定。在产酶溶杆菌OH11中,已知第二信使c-di-GMP对HSAF的生物合成具有调控作用,本研究将c-di-GMP代谢蛋白的编码基因le3756和le1974这2个负调控基因进行敲除,获得双突变菌株△3756△1974,其HSAF产量比野生型提高了 67%,随后在该菌株的基础上敲除RNA伴侣蛋白的编码基因hfq,获得菌株A3756A1974△hfg,与野生型菌株OH11相比,其HSAF产量提高了 1倍;此外,由于c-di-GMP代谢蛋白的编码基因le632对HSAF的生物合成具有正调控作用,因此在双突变菌株A3756△1974中,将le1632的启动子用强启动子Ptac换,得到菌株△2-1632-Ptac,与野生型菌株相比,其HSAF产量提高了 1.7倍。通过对菌株A3756A1974△hfq和A2-l632-Ptac在10%TSB培养基中的生长曲线进行测定,发现其生长没有受到不良影响,其最大细胞密度基本可以达到野生型水平,且在发酵过程中始终保持着稳定的HSAF高产趋势。总之,本研究采用多种方法筛选到2株稳定遗传的HSAF高产菌株,为后续的HSAF高产菌株的选育提供一个参考,为实现其工业化生产奠定基础。