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目的:当金属铅在人体内蓄积时会导致身体多个系统的损伤。有研究显示神经元限制性沉默因子(repressor element silencing transcription factor,REST)是含有锌指结构的蛋白,可以结合神经元限制性沉默元件(neuron-restrictive silencer element,NRSE),从而影响某些特殊基因的表达。hnRNP U(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U)是核不均一核糖核蛋白家族中的一员,作为一种RNA结合蛋白,参与转录及转录后调控过程。近期研究表明,hnRNP U与REST有特异性结合。本实验通过建立动物模型和细胞模型,研究在铅暴露环境下REST和hnRNP U表达的变化,为揭示铅的毒性机制提供依据。方法:1、铅暴露对大鼠海马组织REST和hnRNP U表达的影响:检测到怀孕的雌性大鼠随机分为空白组(CON),低铅暴露组(LLG)和高铅暴露组(HLG),CON饮用双蒸水,LLG饮用0.05%醋酸铅水溶液、HLG饮用0.2%醋酸铅水溶液。以自由饮水的方式进行铅暴露,直至仔鼠断乳(出生后3周)用于后续实验。采用Morris水迷宫系统检测大鼠的学习记忆能力;采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-AES)检测大鼠全血和海马组织中的铅含量;采用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹实验(western blot,WB)和免疫荧光(immunofluorescent,IF)方法检测大鼠海马组织中REST和hnRNP U的表达情况。2、铅暴露对PC12细胞REST和hnRNP U表达的影响:PC12细胞中分别加入0μM、1μM和100μM的醋酸铅,采用RT-PCR、WB方法检测PC12细胞REST和hnRNP U mRNA和蛋白表达情况,进一步采用IF方法检测PC12细胞hnRNP U的表达情况。3、铅暴露环境下干预hnRNP U对REST表达的影响:PC12细胞分为空白组,对照组和实验组,空白组加入0μM醋酸铅,对照组和实验组各加入100μM醋酸铅处理后,空白组和对照组转染DDW,实验组转染hnRNP U-siRNA,采用RT-PCR方法检测hnRNP U和REST mRNA的表达情况;采用IF方法检测REST蛋白表达情况。结果:1、Morris水迷宫实验:铅暴露会损伤大鼠的学习记忆能力。(1)逃避潜伏期:与CON相比,LLG和HLG大鼠的逃避潜伏期时间显著延长,且差异具统计学意义(P<0.05);(2)穿越平台次数:与CON相比,LLG和HLG大鼠的穿越平台次数显著下降(P<0.05);且LLG和HLG之间也存在显著差异(P<0.05)。2、全血和海马组织中铅含量:CON未检测出铅含量,HLG血铅和海马铅含量均高于LLG,且LLG和HLG之间也存在显著差异(P<0.05)。3、铅暴露对大鼠海马组织REST表达的影响:(1)RT-PCR实验表明,与CON比较,LLG和HLG大鼠海马组织REST mRNA表达水平显著上升(P<0.05),且LLG和HLG之间也存在显著差异(P<0.05)。(2)WB实验表明,与CON比较,LLG和HLG大鼠海马组织REST蛋白表达水平显著上升(P<0.05),且LLG和HLG之间也存在显著差异(P<0.05);(3)IF实验表明,与CON比较,LLG和HLG大鼠海马组织CA3、CA1和DG区REST蛋白表达水平显著上升(P<0.05),且LLG和HLG在DG区之间也存在显著差异(P<0.05)。4、铅暴露对大鼠海马组织hnRNP U表达的影响:(1)RT-PCR实验表明与CON比较,LLG和HLG大鼠海马组织hnRNP U mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)。(2)WB实验表明,与CON比较,LLG和HLG大鼠海马组织hnRNP U总蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),但核蛋白表达水平显著上调(P<0.05)。(3)IF实验表明,与CON比较,LLG和HLG大鼠海马组织CA1区hnRNP U核内分布增多,胞浆分布减少,核蛋白表达水平显著上升(P<0.05),且LLG和HLG之间也存在显著差异(P<0.05)。5、铅暴露对PC12细胞REST表达的影响:(1)RT-PCR实验表明,与0μM组比较,1μM组和100μM组REST mRNA表达水平显著上升(P<0.05),且1μM组和100μM组之间也存在显著差异(P<0.05);(2)WB实验表明:与0μM组比较,1μM组和100μM组REST蛋白表达水平显著上升(P<0.05),且1μM组和100μM组之间也存在显著差异(P<0.05)。6、铅暴露对PC12细胞hnRNP U表达的影响:(1)RT-PCR实验表明,与0μM组比较,1μM组和100μM组hnRNP U mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)。(2)WB实验表明:与0μM组比较,1μM组和100μM组hnRNP U蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。(3)IF实验表明,与0μM组比较,1μM组和100μM组hnRNP U核内分布明显增多,胞浆分布明显减少,核蛋白表达量显著上调,且1μM组和100μM组之间也存在显著差异(P<0.05)。7、干预hnRNP U对REST表达的影响:(1)RT-PCR实验表明,与空白组比较,对照组hnRNP U mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),与对照组比较,实验组hnRNP U mRNA表达水平显著下降(P<0.05);与空白组比较,对照组REST mRNA表达水平显著上升(P<0.05),与对照组比较,实验组REST mRNA表达水平显著下降(P<0.05)。(2)IF实验表明,与空白组比较,对照组REST蛋白表达水平显著上升(P<0.05);与对照组比较,实验组REST蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论:铅暴露通过促进hnRNP U发生核转位,上调REST的mRNA表达水平,使其蛋白表达量增加,进一步影响REST调控的下游基因的表达,从而对学习记忆造成损伤。这为探讨铅的神经毒性机制提供理论依据,并为寻找治疗铅中毒的新药物提供新思路。