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禽波氏杆菌病是由禽波氏杆菌(Bordetella avium,B.avium)引起的一种高度接触传染性疫病。近年来的研究表明该病在不同地区的鸡群中感染率为10%～50%,患病鸡群多数生长迟缓,饲料报酬低,对家禽养殖业造成了较大的经济损失。在我国该病主要引起鸡胚死亡,孵化率降低,雏鸡的急性死亡。1周龄内的雏禽最易感,发病雏禽表现为气喘、精神沉郁、饮食欲降低,多数因衰竭或继发其他传染病而导致生长缓慢或死亡。1月龄以上的鸡有一定的抵抗力,成鸡感染后基本无异常表现,为健康带菌,但其所产种蛋带菌,可造成本病的垂直传播。近年来,细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白(outer-membrane-protein,OMP)的免疫作用越来越受到科技人员的关注,并进行了研究。实验证明,OMP具有良好的免疫原性,不仅可刺激体液免疫,而且也可刺激细胞免疫作用。基于病原菌的常规分离、鉴定方法费时费力,2~3d内不能得出准确结果。而单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)具有特异性强、敏感性高、只识别单一抗原位点等特性,所以其在病原检测、病原亚型鉴别等方面具有不可替代的优点,在国内外生物医学领域得到了广泛的研究和应用。因此本试验提取并纯化了禽波氏杆菌的OMP,用制备并纯化的禽波氏杆菌OMP免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,研制成功了禽波氏杆菌OMP单克隆抗体,这为禽波氏杆菌ELISA诊断试剂盒的研制和胶体金试纸条等快速检测方法、抗原表位分析、细菌分型和临床治疗等方面奠定了基础。本课题主要研究内容包括以下三个方面:试验一、禽波氏杆菌OMP间接ELISA检测方法的建立本试验采用改良的Wooldridge法提取了禽波氏杆菌P5株外膜蛋白(OMP),通过Bradford方法测定禽波氏杆菌OMP含量为640μg/mL,SDS-PAGE电泳检测禽波氏杆菌OMP含有5种成分,分子量分别为58、47、41、36、24KD;将提取的禽波氏杆菌OMP经凝胶层析柱分离纯化,得到分子量为58KD的主蛋白带。用纯化的禽波氏杆菌OMP免疫Balb/c小鼠,每2周免疫1次,共计免疫4次,获得了鼠抗禽波氏杆菌OMP的抗血清,以此抗血清建立了检测禽波氏杆菌OMP的间接ELISA方法,试验结果表明抗原、抗血清最佳工作浓度分别为10μg/mL、1:12800,酶标二抗工作浓度为1:10000,用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH9.6)作包被液;选择含1% BSA的PBST作封闭液;最佳包被条件为4oC、24h包被;最佳封闭条件为37oC、2h;血清反应时间为60min;酶标抗体反应时间为60min;底物反应时间为15min。本试验为检测小鼠免疫禽波氏杆菌OMP后体内抗体效价和杂交瘤细胞筛选过程中培养上清中抗体水平的高低、以及制备的腹水抗体效价的高低、筛选分泌禽波氏杆菌OMP单克隆抗体杂交瘤细胞株奠定了基础。试验二、禽波氏杆菌OMP杂交瘤细胞株的建立及单克隆抗体的制备本试验用纯化的禽波氏杆菌OMP免疫6~8周龄的Balb/c小鼠,每2周免疫一次,三免后用建立的间接ELISA法测定小鼠的血清效价,取血清效价较高的小鼠进行加强免疫。利用单克隆抗体技术,在加强免疫4天后,取Balb/c小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞,在50% PEG4000的作用下进行细胞融合,融合率达65%,用建立的间接ELISA方法进行筛选,阳性率为12%。取阳性值最高的细胞孔进行有限稀释法克隆,经4次克隆,获得了3株稳定分泌抗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3G10、4A3和4E8株,这三株杂交瘤细胞株均能稳定的分泌抗禽波氏杆菌OMP的单克隆抗体。试验三、禽波氏杆菌OMP单克隆抗体生物学特性研究本试验对制备的禽波氏杆菌OMP单克隆抗体的生物学特性进行鉴定。经间接ELISA法测定,杂交瘤细胞培养上清液抗体的效价分别为1:320、1:640和1:640,腹水的效价分别为1:6400、1:12800和1:12800。其IgG亚类为2株IgG1和1株IgG3。经Western-blot鉴定表明这3株单抗均具有良好的特异性。这3株杂交瘤细胞冻存3次复苏后仍能稳定分泌抗体。本研究将为禽波氏杆菌标准诊断试剂盒的研制、菌体表面抗原表位的分析和细菌分型系统的建立等奠定基础。