顺铂通常作为一种抗癌药物,有研究表明,在对睾丸生殖细胞肿瘤(TGCTs)进行联合化疗的过程中,顺铂的引入有助于将治愈率从5%提高到目前的90%。其抗癌机理在于,铂类药物被细胞摄取后,铂原子与DNA共价结合形成链内交联和链间交联,形成Pt-DNA加合物,造成DNA损伤,从而引起多种细胞反应,如复制阻滞、转录抑制、阻滞细胞分裂周期,最终引起癌细胞死亡。在DNA损伤的过程中,会产生一系列的响应蛋白,其中包括HMGB1蛋白,它是一种高迁移率族染色体蛋白,被认为是Pt-DNA加合物的主要结合蛋白,对Pt-DNA交联有非常高的亲和力。它可以识别并结合损伤或弯曲的DNA,对损伤位点进行屏蔽,从而可以抑制细胞内的修复蛋白对损伤的DNA进行修复,进一步促进癌细胞的死亡,达到癌症治疗的目的。因此研究HMGB1蛋白与Pt-DNA间的相互作用对了解铂类药物的药理作用、DNA损伤修复和癌细胞的耐药性具有重要意义。目前,研究人员已经提出了不同的方法研究二者之间的相互作用,如利用X射线衍射解析晶体结构、分子动力学模拟、构建DNA探针捕获蛋白进行质谱分析等,但是这些方法仍然存在弊端:一方面无法对二者之间的识别与结合进行动态的可视化研究,另一方面实验的结果是整体效应,得到的“平均化”的结果,一些分子信息可能被隐藏在群体中。所以目前为止,仍然缺乏一种在单分子水平上可视化研究Pt-DNA和HMGB1蛋白的动态相互作用的方法。由于DNA纳米结构具有可寻址性,而且可以自行定制尺寸和形状,在这里,我们构建了矩形DNA折纸,并将其作为Pt-DNA和HMGB1蛋白相互作用的研究平台,利用单分子观测技术,对单个分子间的相互作用实现可视化的动态观察。具体内容如下:(1)通过凝胶迁移实验(EMSA)和荧光共振能量转移(FRET)对HMGB1蛋白和Pt-DNA的相互作用进行宏观表征。通过EMSA可以观察到二者结合与未结合时条带的不同,当二者结合时,复合物迁移缓慢,所以条带位置高,而且产生拖尾的现象。FRET实验可以进一步表明HMGB1蛋白是与损伤位点的结合,而非DNA的其他位点。(2)首先构建了DNA矩形折纸结构,并将Pt-ssDNA锚定在折纸平台上,将其作为HMGB1蛋白和Pt-dsDNA相互作用的研究平台。利用原子力显微镜(AFM)对反应后的产物进行单分子形貌观察,发现当HMGB1蛋白识别并结合到损伤位点后,其相对于折纸平台的高度为1nm左右。(3)利用全内反射显微镜(TIRF)对HMGB1蛋白和Pt-DNA的相互作用进行单分子动态观察。首先构建了带有biotin修饰的DNA矩形折纸结构,并将其固定在成像皿上,加入HMGB1蛋白后,500s后可以看到荧光信号强度明显上升,表明HMGB1蛋白与Pt-DNA发生结合,同步观察到FRET信号提升,进一步表明HMGB1蛋白与损伤位点的结合。接下来我们对没有加入折纸的体系进行单分子成像,发现HMGB1蛋白和Pt-DNA的共定位效果和FRET效率更低。经过统计发现,将DNA折纸作为研究平台,结合效率达到40%,相比于未加入折纸的体系结合效率提升了30%,而且在100s左右达到二者相互作用的平衡状态,而传统平台需要500s。这些结果表明将DNA折纸作为研究平台,可以HMGB1蛋白快速识别损伤位点,而且结合效率更高。这种方法将DNA折纸作为研究平台,并利用单分子观测技术,在单分子水平上实现了对HMGB1蛋白和Pt-DNA相互作用的可视化研究,避免了先前方法的整体效应,为研究二者相互作用提供了新思路,而且有助于人们进一步了解HMGB1蛋白对损伤DNA的作用机制。