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肌肉细胞分化是发育生物学的重要课题。肌肉细胞分化具有很复杂的分子机制,涉及到了多个肌肉相关基因、转录调控家族因子、信号通路的作用。肌肉调节因子家族MRFs(muscle regulatory factors,MRFs)和肌肉增强子2(myocyte enhancer factor2,MEF2)家族因子在肌肉分化过程中起着决定性的调控作用。而近来的研究发现表明组蛋白修饰酶也参与到肌肉细胞分化调控机制中并发挥了重要作用。然而目前的研究主要围绕在组蛋白修饰酶与MyoD的相互作用,对于组蛋白修饰酶与MyoD下游的转录调节因子在肌细胞分化进程中是何关系的研究很少。本研究在研究猪组蛋白甲基化酶Suv39h1基因在猪体内的表达模式的基础上;初步分析猪组蛋白甲基化酶Suv39h1在猪肌卫星细胞中的生物学功能;并利用小鼠C2C12成肌细胞阐明组蛋白甲基化酶Suv39h1通过对MEF2的作用影响肌肉分化的机制。本研究对于深入了解肌肉细胞分化机制具有重要的理论价值。结果如下:1.猪组蛋白甲基化酶Suv39h1基因及其辅助子异染色质蛋白HP1基因的克隆通过电子克隆技术、RT-PCR方法,从3月龄梅山猪背最长肌RNA模板中克隆分离出Suv39h1和HP1基因的全长编码区。保守结构域预测显示猪组蛋白甲基化酶Suv39h1及其辅助子异染色质蛋白HP1(Heterochromatin Protein 1,HP1)具有典型的保守结构域结构:Suv39h1具有典型的Suv39h家族蛋白结构域:chromo domain和SET domain。HP1具有典型的异染色质蛋白家族的典型蛋白结构:chomo domain和chromo shadow domain。2.组蛋白甲基化酶Suv39h1在梅山猪组织表达模式分析分别通过半定量和定量PCR方法分子Suv39h1在梅山猪组织表达模式。表达模式结果表明:Suv39h1在生后90天梅山猪的心、肝、脾、肺、肾、大脑、小脑、咬肌、直肠、半腱肌、肩脂、背脂、比目鱼肌、背最长肌、股二头肌组织中均有表达。Suv39h1在胚胎65天,出生后3天、35天、90天、150天及180天的最长肌、咬肌、半腱肌和股二头肌中的表达没有明显变化。3.组蛋白甲基化酶Suv39h1在猪肌卫星细胞中的调控作用分析在猪肌卫星细胞中超表达或干扰Suv39h1,培养细胞48h进行流式分析,检测细胞周期。结果发现,超表达Suv39h1能够抑制猪肌卫星细胞在S期的DNA合成,使细胞滞留在g0/g1期。edu标记超表达suv39h1的肌卫星细胞同样表明超表达suv39h1能够减少猪肌卫星细胞在s期的细胞数量。2%马血清分化超表达或干扰suv39h1处理的肌卫星细胞8天,免疫染色肌细胞分化晚期标志蛋白myhc。免疫荧光结果表明,猪肌卫星超表达或干扰suv39h1,细胞显示myhc的数量明显少于对照组。4.组蛋白甲基化酶suv39h1影响成肌细胞分化的机制(1)组蛋白甲基化酶suv39h1对成肌细胞增殖的影响在c2c12细胞中超表达或干扰suv39h1,培养细胞48h进行流式分析,检测细胞周期。结果发现,超表达suv39h1能够抑制c2c12细胞在s期的dna合成,使细胞滞留在g0/g1期。而干扰suv39h1能够提高c2c12细胞在g2/m期的数量。edu标记超表达suv39h1的c2c12细胞同样表明超表达suv39h1能够减少c2c12细胞在s期的细胞数量。(2)组蛋白甲基化酶suv39h1对成肌细胞分化的影响2%马血清分化超表达或干扰suv39h1处理的c2c12细胞8天,免疫染色肌细胞分化晚期标志蛋白myhc。免疫荧光结果表明,c2c12细胞超表达或干扰suv39h1,细胞显示myhc的数量明显少于对照组。在c2c12细胞中超表达或干扰suv39h1,生长培养以及2%马血清分别分化培养2天、4天、6天,通过定量pcr方法分析c2c12细胞分化过程中的分化早晚期标志基因的表达模式。结果显示,超表达suv39h1的c2c12细胞和干扰suv39h1的c2c12细胞中myf5的表达趋势完全相反。超表达suv39h1的c2c12细胞随着分化时间的增加,myf5的表达呈现上调,而干扰suv39h1的c2c12细胞随着分化时间的增加,myf5的表达呈现下调。在超表达或干扰suv39h1的c2c12细胞细胞随着分化时间的增加,mef2c和myhc的表达趋势同对照组相比没有明显变化。(3)组蛋白甲基化酶suv39h1通过与mef2c作用抑制mef2c下游靶基因转录激活2%马血清分别分化处理c2c12细胞0天、2天、4天和6天,免疫染色suv39h1,hp1和mef2c在细胞中的定位情况。结果显示:随着c2c12细胞分化天数的增加,suv39h1,hp1和mef2c在细胞中一直存在于细胞核内。哺乳动物双杂交实验结果表明:suv39h1与mef2c之间的相互作用存在于未分化的c2c12细胞,在分化的C2C12细胞中二者不存在相互作用。免疫共沉淀实验结果证实Suv39h1与MEF2C在未分化的C2C12细胞中存在相互作用。MEF2报告系统分析结果表明:Suv39h1能够抑制MEF2C下游靶基因的转录活性。(4)HP1抑制Mef2c的转录激活超表达HP1显著降低Mef2c启动子活性和Mef2c在C2C12细胞的表达。综上所述,本研究的结论是:组蛋白甲基化酶Suv39h1参与猪肌卫星细胞和C2C12细胞的细胞周期调控。超表达Suv39h1能够抑制猪肌卫星细胞和C2C12细胞分化。Suv39h1与MEF2C之间的相互作用存在于未分化的C2C12细胞,二者能够在未分化的C2C12细胞中形成Suv39h1-MEF2C复合体,并且Suv39h1协同HP1能显著抑制MEF2C下游靶基因的转录活性。