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背景:果蝇Asx(Additional sex combs)基因是ETP(Enhancers of trithorax and Polycomb)基因的一种,其编码的蛋白能调节或招募Polycomb抑制复合体(Polycomb-group repressor complex,PRC)和trithorax激活复合体(trithorax-group activator complex)。Asxl2基因是果蝇Asx基因的哺乳动物同源类似物,在2003年被鉴定出来,之后在乳腺癌,前列腺癌,膀胱癌,胰腺癌等多种人类癌症中发现人ASXL2基因的突变。近年来的研究发现,Asxl2在哺乳动物心脏中高表达并且对哺乳动物心脏的正常发育是必需的,Asxl2-/-小鼠的心脏功能出现缺陷。但是关于Asxl2在疾病中的功能和分子机制的研究尚不深入。有研究发现,Asxl2与泛素羧基末端水解酶Bap1(BRCA1 associated protein 1)形成一个复合体,去除组蛋白H2A第119位赖氨酸单泛素化(H2AK119ub1)的修饰。Asxl2-Bap1复合体的催化活性与Asxl2功能的关系需要进一步研究。目的:本研究中,我们想要证明Asxl2在小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,m ESC)向心肌细胞分化过程中的作用。并且找到Asxl2结合蛋白,为阐明其分子机制打下基础。方法:利用CRISPR/Cas9n系统,构建Asxl2基因敲除的mESC单克隆细胞系,提取基因组DNA,genotyping PCR扩增出靶位点附近的DNA片段并测序,Western blot检测Asxl2的表达;利用悬滴法,将野生型m ESC和Asxl2基因敲除的m ESC单克隆细胞系向心肌细胞分化,在分化的2~9天观察细胞形态的变化,在分化第9天统计能自发跳动的细胞团所占的比例,在分化第0、2、5天检测心肌发育转录因子Mef2c(myocyte enhancer factor2)、Hand1(heart and neural crest derivatives expressed transcript 1)的表达;利用免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP),在m ESC细胞中检测Asxl2结合蛋白。结果:第一部分:利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因稳定敲除的m ESC单克隆细胞系1.成功构建靶向Asxl2基因的CRISPR/Cas9n重组质粒。2.将2个重组质粒共转染m ESC细胞,嘌呤霉素筛选后得到亚克隆细胞系,经genotyping PCR扩增出靶位点附近的序列并测序,验证得到一株Asxl2基因突变的单克隆细胞系。3.Western blot证实该m ESC单克隆细胞系中Asxl2表达缺失。第二部分:Asxl2基因是m ESC向心肌细胞分化所必需的1.Asxl2基因稳定敲除的mESC单克隆细胞系与野生型mESC细胞相比,在向心肌分化过程中,表型发生改变。2.Asxl2基因稳定敲除的m ESC单克隆细胞系与野生型m ESC细胞相比,在分化第9天能形成自发节律性收缩的细胞团比例减少。3.Asxl2基因稳定敲除的m ESC单克隆细胞系与野生型m ESC细胞相比,在分化过程中心肌发育转录因子Mef2c、Hand1的表达下降。第三部分:在体内,Asxl2与Bap1能结合,而不与Ezh2结合结论:1.小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中需要Asxl2的调节。2.Asxl2与Bap1结合,与Ezh2并不能结合。