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一、背景肩袖撕裂（Rotator Cuff Tear,RCT）是运动损伤中最为常见的一类疾病,且其发病率有随年龄增长逐年增多的趋势。较为严重的肩袖损伤往往难以靠自身愈合,大多需要经过关节镜进行缝合修补,但即使经过手术治疗,其术后再撕裂率仍可高达20%以上。这可能与肩袖腱骨结合部（Bone-Tendon Junction,BTJ）复杂的解剖结构有关,手术治疗往往不能恢复其原有的梯度结构,只能瘢痕愈合。所以,运动医学的医生一直致力于如何促进BTJ结构的有效愈合,降低术后再撕裂的发生。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）由于具备自我更新以及多向分化潜能而受到研究者们的青睐。多项研究已经表明局部应用间充质干细胞治疗能够促进损伤结构的修复。肌节同源盒（musclesegmenthomeobox,Msx）是促进干细胞再生的重要基因之一,可以调控组织生长发育与再生。有研究表明,Msx1很可能作为干细胞增殖和分化的重要的调控靶点。所以如果能通过研究彻底弄清Msx1对MSCs的调控作用,并能有效的将二者结合应用于腱骨结合部损伤的修复中,很有可能实现显著的改善肩袖损伤重建的预后。所以,本研究旨在探究Msx1对MSCs的影响以及可能的调控机制,为下一步应用于腱骨结合部的损伤治疗打下理论基础。二、研究目的第一部分:分离提取并鉴定原代BMSCs,通过慢病毒构建稳转Msx1的BMSCs细胞,在RNA和蛋白层面分别检测Msx1在细胞内的表达情况。第二部分:探究体外实验中过表达Msx1对BMSCs增殖、分化、迁移的影响及可能机制。第三部分:探究体内实验中过表达Msx1的BMSCs对大鼠肩袖损伤模型损伤修复的作用。第四部分:通过转录组测序,进一步筛查Msx1发挥上述功能的作用位点以及可能的机制。三、研究方法第一部分:（1）分离提取原代SD大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）,分别进行流式细胞鉴定、成骨诱导分化、成脂诱导分化、成软骨诱用于验证所提取原代rBMSCs是否符合MSCs具有多项分化潜能的特征;（2）构建Msx1过表达慢病毒,摸索慢病毒感染原代rBMSCs条件,获得能够稳定上调Msx1的rBMSCs,并通过qPCR及WB进行验证转染效果。第二部分:（1）通过CCK-8检测Msx1-rBMSCs增殖能力的变化情况;（2）分别采用成骨、成软骨、成脂肪诱导,并进行茜素红、阿斯利蓝、油红O染色来检测过表达Msx1对rBMSCs分化能力的影响情况;（3）采用细胞划痕和Transwell实验检测Msx1-rBMSCs迁移能力的变化情况;（4）分别提取过表达Msx1和对照组BMSCs的蛋白,对细胞迁移相关的蛋白进行检测,探究可能的机制。第三部分:（1）用3D水凝胶负载过表达Msx1的BMSCs;（2）构建SD大鼠肩袖损伤模型,在SD大鼠肩关节腱骨结合处注射Msx1-rBMSCs-水凝胶;（3）按时间点处死并获取SD大鼠肩关节,进行Micro-CT检测,对于大鼠腱骨愈合的成骨情况进行影像学评价;（4）分别进行HE、番红固绿及Masson染色对腱骨愈合情况进行组织学评价;（5）剔除大鼠肩关节多余组织,仅保留冈上肌及肱骨,进行生物力学检测评价。第四部分:（1）利用RNA-Seq技术对Msx1-rBMSC和对照组细胞,进行转录组的测序分析,用于差异基因的筛选;（2）最后利用qRT-PCR和Western-Blot对可能的关键基因和蛋白进行了验证,进一步探究过表达Msx1后激活TGF-β/P-Smad可能的中间环节,阐明Msx1对于促进间充质干细胞迁移能力提高可能的机制。四、研究结果第一部分:（1）本部分实验中从SD大鼠股骨提出的原代rBMSCs经过三系分化诱导培养证明具备多项分化潜能;经过表面抗原流式鉴定符合干细胞表面标记的流式鉴定标准,且经过传代培养纯度可以达到95%以上,可以用于后续实验;（2）通过荧光显微镜下观察,并且从蛋白水平（WB）和基因水平（qPCR）进行验证,按照MOI 80可以较好的实现通过慢病毒转染原代rBMSCs过表达Msx1,用于后续体外实验和体内实验。第二部分:（1）对过表达Msx1的rBMSCs和对照组rBMSCs,分别进行细胞增殖能力检测（CCK-8）,我们发现过表达Msx1组的rBMSCs相较于对照组增殖能力显著提高,差异有统计学意义;（2）对过表达Msx1的rBMSCs和对照组rBMSCs,分别进行3周的三系诱导分化培养,并在显微镜下观察。相较于对照组而言,过表达Msx1组的rBMSCs在成骨和成软骨能力上要有所下降,成脂能力显微镜下观察没有明显区别,总体而言,过表达Msx1的rBMSCs分化能力有所下降;（3）对过表达Msx1的rBMSCs和对照组rBMSCs,分别进行划痕实验和Transwell实验,发现过表达Msx1可以显著提高rBMSCs的迁移能力,和对照相比差异有统计学意义;（4）分别提取过表达Msx1的rBMSCs和对照组rBMSCs的蛋白,对迁移相关的标志性蛋白进行了检测,我们发现过表达Msx1组的P-Smad2和P-Smad3较对照组有所升高,可能Msx1是通过激活了 TGF-β/P-Smad通路,增强了 rBMSCs的迁移能力。第三部分:（1）3D水凝可以作为细胞载体负载rBMSCs,从镜下观察、活死细胞染色、细胞增殖实验可以看出,细胞在3D水凝胶内生长状态良好,能够很好的进行增殖,可以应用于细胞培养及体内注射;（2）本部分研究中的大鼠肩袖损伤模型具有可重复性高、一致性较好的特点,能够为实验提供稳定的动物损伤模型;（3）将过表达Msx1-rBMSCs经过3D水凝胶负载后对大鼠肩袖损伤模型局部进行注射治疗,从Micro-CT、组织学切片、生物力学检测结果综合来看,可以起到促进骨和胶原的再生和长入,一定程度上改善组织的有序长入,最终提高重建组织的生物力学强度的。第四部分:（1）通过RNA-Seq对过表达Msx1的rBMSCs及其对照组细胞进行转录组测序,通过将P值设定为小于0.05以及log2foldchange大于1进行筛查,最终获得了包含Aspn在内的126个差异基因出现了显著变化;经过qRT-PCR对筛选出的部分差异基因进行检测发现,基因上调和下调趋势同转录组测序结果大体接近,说明测序结果能较好的反应实际情况;（2）通过测序进行筛选以及对基因信息的相关检索,最终把Msx1可能的影响靶点放在Aspn上,通过WB实验验证通过对Msx1-rBMSCs组应用Si-Aspn进行干扰,成功阻断了 Msx1对于P-Smad2和P-Smad3的上调,这也证明了过表达Msx1可能通过影响Aspn而激活了 TGF-)β/P-Smad通路从而最终提高细胞迁移能力的假设。五、研究结论本课题通过体外实验、体内实验和细胞的转录组测序,从多维度探究了 Msx1对rBMSCs的增殖、分化、迁移能力的影响,并探究了其对于rBMSCs迁移能力产生影响可能的内在机制,即过表达Msx1后通过上调Aspn基因,从而激活了 TGF-β/P-Smad通路,最终增强了细胞的迁移能力。通过体内实验验证了通过3D水凝胶对过表达Msx1-rBMSCs负载有助于促进大鼠肩袖损伤的愈合,结合体外细胞表型实验结果一定程度上也证明了 Msx1在调控rBMSCs进行组织损伤修复的时候可能采取了让细胞先增殖、迁移而后分化的调控模式,并最终促进了损伤愈合,具体机制还有待于进一步的研究。