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聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)被普遍认为是安全无毒、具有独特理化性质和良好生物相容性的药用辅料,也是经FDA批准的极少数可以体内注射的合成聚合物之一,在医药领域有十分广泛的应用。然而有研究表明PEG在体内并非是惰性物质,也会引起一定的生物学效应如抑制外排泵P-糖蛋白活性、抑制CYP3A活性及诱导CYP3A表达等,从而影响药物的分布、代谢途径等。不同聚合度或者不同基团修饰的PEG可能会有不同的性质,其生物学效应也不同。本研究建立了基于LC-MS/MS分析方法的“cocktail”探针人肝微粒体(HLMs)孵育体系,考察了 5种聚合度的PEG对HLMs中8种CYP酶的抑制作用。本文建立了同时测定HLMs孵育体系中9种探针代谢产物浓度的LC-MS/MS分析方法。孵育样品经冰甲醇沉淀蛋白,上清液用甲醇:水(1:1,v/v)稀释后,经Agilent 300SB-C18柱色谱分离,以甲醇-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱;采用电喷雾离子源(ESI源),多反应监测(MRM)扫描方式,进行正负离子切换检测,在一次进样分析中同时定量正谱和负谱检测模式下的离子对,分析时间为6 min。连续三个批次的验证试验证明所建立的分析方法灵敏、准确度高、重现性好,能够应用于孵育样品中探针代谢产物的检测定量。本研究中发现PEG会严重影响某些与其共洗脱的待测产物的质谱信号,通过监测不同聚合度PEG的共同源内裂解离子对m/z 133.1→89.1,优化色谱梯度,使4种PEG与代谢产物色谱分离,消除了其对代谢产物测定的影响,只有PEG400的保留时间与部分待测物接近,研究中考察了受PEG400影响的待测物,对测定结果进行校正,避免了孵育试验的假阳性或假阴性结果。本文建立了测定HLMs中8种CYP450酶活性的“cocktail”探针孵育体系,将探针底物分为两组,Group Ⅰ考察的酶为CYP1A2、CYP3A、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1,对应使用的探针及其浓度分别为非那西丁 10μM、睾酮10μM、甲苯磺丁脲80 μM、美芬妥英40 μM、右美沙芬2.5 μM、氯唑沙宗20 μM,GroupⅡ考察的CYP450酶为CYP3A4、CYP2A6、CYP2B6,各探针底物浓度分别为咪达唑仑2.5 μM、香豆素5 μM、安非他酮20 μM。孵育体系中HLMs蛋白浓度为0.2mg/mL。优化了 NADPH的浓度及孵育时间,优化后的NADPH浓度为5 mM,孵育时间为Group Ⅰ20 min、Group Ⅱ10 min。并对此体系中代谢反应的特异性进行了初步验证,结果表明“cocktail”体系中各探针代谢反应的特异性良好,混合探针之间的相互作用可以忽略。利用已建立的“cocktail”探针孵育体系考察了浓度为0.1μM～1 mM的PEG400、mPEG2K、mPEG5K、mPEG10K、mPEG20K 对 HLMs 中 8 种 CYP 酶的抑制作用。当PEG浓度达到1 mM时,低聚合的PEG400孵育体系中各CYP酶剩余活性均大于90%,mPEG2K孵育体系CYP酶剩余活性均大于80%,mPEG5K孵育体系中除CYP2B6的剩余酶活为78.1%,其他CYP酶活性均大于90%;而高聚合度的mPEG10K和mPEG20K均抑制了 CYP2B6 50%以上的活性,mPEG10K抑制了 CYP1A2 46%的活性及CYP2C19 48.9%的活性。各聚合度PEG对不同CYP酶的IC50值均较高,大部分高于5 mM,而mPEG1OK对CYP1A2的 IC50 为 1.26 mM、对 CYP2C19 的 IC50 为 1.18 mM,对 CYP2B6 的 IC50 为 1.06 mM,mPEG20K对CYP2B6的IC50为0.93 mM。结果表明PEG对CYP酶的抑制作用是与其聚合度相关的;相对其他CYP酶,CYP2B6的活性受PEG影响较大。总体而言,本研究考察的几种PEG是对CYP酶抑制作用十分微弱的物质,但是PEG作为广泛使用的药用辅料,其伴随给药剂量可能会很高,当给予高剂量的PEG时,也可能会抑制CYP酶活性而引起药物相互作用。