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棒曲霉素(PAT)是一种具有免疫毒性、神经毒性、遗传毒性、生殖毒性等多种毒性的真菌毒素,人体摄入后会被消化道吸收,随即作用体内各组织器官,导致慢性或急性中毒,能致癌、致畸、致突变、诱发免疫抑制等。芹菜素(API)是天然、低毒、无诱变性的黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗敏舒缓等多种生理活性。本实验旨在前期研究PAT对人胚肾细胞(Human embryonic kidney 293 cells,HEK293)毒性机制的基础上,阐明API对PAT诱导HEK293细胞损伤和凋亡的抑制作用机理。实验结果如下:(1)采用细胞活力(MTT)检测发现,API(2.5、5、10μM)预处理或PAT与API(8+2.5、8+5、8+10μM)协同处理方式均能有效缓解PAT引起的肾细胞活力降低,因此后期实验我们均采用API与PAT同时作用的方式处理肾细胞。2.5、5、10μM API协同作用使细胞活力从PAT抑制的71.4%分别显著上升至80.4%、91.2%和92.8%。LDH释放和细胞凋亡染色结果也证实,API对PAT诱导的LDH释放增加及细胞凋亡具有显著的抑制作用,具有剂量-效应关系。本实验采用的API剂量不会对HEK293细胞产生毒性。(2)API能够缓解PAT诱发的活性氧(ROS)含量升高及线粒体功能损伤。API显著降低ROS含量至细胞正常水平,来缓解PAT诱导的HEK293细胞氧化应激损伤、平衡细胞内氧化还原状态;API显著恢复PAT导致的HEK293细胞线粒体膜电位丧失,维护线粒体膜结构完整性和功能性;API显著提升PAT抑制的细胞内ATP含量至正常水平,维持氧化磷酸化过程的顺利进行,保证细胞内正常的能量供应。(3)API能够通过调节线粒体呼吸链复合体,尤其是复合体Ⅰ(NDUFA4)、复合体Ⅱ(SDHA)和复合体Ⅴ(ATP6、ATP8)的表达,来调控PAT诱导的线粒体氧化磷酸化过程紊乱。结果表明,PAT显著抑制复合体Ⅰ、复合体Ⅲ、复合体Ⅳ和复合体Ⅴ的表达,上调复合体Ⅱ的表达。10μM API保护作用使复合体Ⅰ、ATP6、ATP8基因表达较PAT处理组分别显著上调15%、55%和31%,复合体Ⅱ基因表达显著下调25%。2.5μM API作用后使复合体Ⅰ、ATP8蛋白表达较PAT处理组分别上调60%和20%。5μM API保护后使ATP6蛋白表达较PAT处理组显著上调75%,复合体Ⅱ蛋白表达显著下调79%。API对呼吸链复合体Ⅲ和Ⅳ表达异常无明显调控作用。(4)Caspase信号途径是PAT诱导细胞凋亡的下游途径。实验证实,API显著下调PAT诱导的Bax和p53过表达,缓解PAT导致的Bcl-2表达抑制,抑制线粒体外膜通透性不可逆扩大和Bax介导的膜孔道开放,来阻止Cyt c的释放,从而阻断后续caspase通路的激活。API显著干预PAT激活凋亡起始caspase-2、-8、-9及凋亡执行caspase-3、-6、-7,下调caspase基因过表达、抑制caspase蛋白裂解活化并降低caspase酶活性。API能够通过内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径同时阻止PAT激活的caspase级联信号放大,从而保护HEK293细胞免受凋亡。