论文部分内容阅读
研究背景:化疗是白血病以及其它肿瘤的主要治疗手段,随着化疗药物的广泛应用,肿瘤的耐药性问题越来越突出,已成为肿瘤化疗失败的主要原因之一。肿瘤多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时,对其他多种化学结构不同、作用靶位不同的抗肿瘤药物也产生耐药。目前有关肿瘤耐药机制的研究主要是从多药耐药基因表达的蛋白入手,探讨这些蛋白在形成耐药机制中的作用。研究表明,P-gp糖蛋白、多药耐药相关蛋白、肺耐药蛋白、乳腺癌耐药相关蛋白、DNA拓扑异构酶Ⅱ和谷胱甘肽S转移酶等多药耐药相关蛋白质与肿瘤多药耐药性相关。虽然已有的研究揭示了一些肿瘤多药耐药机制,但目前仍然不能完全解释肿瘤多药耐药现象,临床上也缺乏逆转肿瘤细胞多药耐药的有效途径。微小RNA(MicroRNA,简称miRNA)是一类长约19nt-23nt的单链非编码RNA,广泛存在于植物及动物中,具有物种及组织特异性,进化上高度保守。miRNA可与其靶mRNA的3′非翻译区(3′untranslated regions,3’-UTRs)特异性结合,导致靶mRNA的翻译抑制或降解,在细胞分化、增殖与凋亡、个体发育、机体代谢、病毒感染及肿瘤的发生发展等方面具有重要的生物学功能。新近,miRNA在肿瘤多药耐药中的作用也引起了关注,与乳腺癌、卵巢癌、胃癌等相关的多药耐药miRNA相继报道,但白血病耐药相关miRNA的研究在世界范围内尚未见报道。本研究拟通过白血病细胞株及其耐药株的对比研究,筛选出白血病的多药耐药相关miRNA,首次从miRNA调节环节探索白血病耐药机制,为进一步研究其在多药耐药机制中的作用奠定基础。目的:采用microRNA芯片筛选出K562细胞及其耐药株K562/A02细胞差异表达的miRNA,并用荧光定量RT-PCR对筛选出来的miRNA进行验证,进一步确定白血病耐药相关miRNA。方法:常规培养K562及K562/A02细胞株,取等量K562细胞和K562/A02细胞,Trizol法分别抽提两种细胞的总RNA;通过YM-100(Millipore)微离心过滤柱得到片段小于300nt的小RNA,对K562和K562/A02细胞的小RNA分别进行Cy3和Cy5荧光标记,然后进行microRNA芯片杂交反应;采集芯片原始信号值并将图像信号转化为数字信号,将两芯片的信号值进行比对筛选出差异表达miRNA;应用实时荧光定量RT-PCR方法对筛选出的miRNA进行可靠性验证,鉴定出白血病耐药相关miRNA。结果:microRNA芯片结果显示,与K562细胞相比,K562/A02细胞中有22条miRNA存在表达差异(P＜0.01),表达差异在2倍以上的有9条,其中miR-221,miR-155,miR-451表达上调;miR-98,miR-181a,let-7f,miR-424,let-7g和miR-563表达下调。荧光定量RT-PCR对miR-221,miR-181a,miR-451和let-7f的检测结果与miRNA芯片的结果相符合,miR-451、let-7f在白血病细胞株表达差异显著。结论:miR-221,miR-181a,miR-155,miR-451,miR-98,let-7f,miR-424,let-7g和miR-563在K562细胞和K562/A02细胞之间存在差异表达,提示这些miRNA尤其是miR-451与let-7f可能与白血病多药耐药相关。