ERD2（ER-retention defective）是一个在真核生物中广泛存在的膜蛋白,它能识别一些蛋白质羧基末端的H/KDEL基序,并将具有此类基序的蛋白质回收至内质网。ERD2最初是在酵母中鉴定的,其同源蛋白在动物细胞中的生物学功能和作用机理得到了深入研究,但在病原微生物,尤其是在植物病原真菌致病过程中所起的作用及调控机制尚不清楚。最近,韩国一个研究小组报道,ERD2的稻瘟菌同源蛋白在菌丝生长、分生孢子产生和致病性中发挥着重要作用。本实验室在前期研究中,通过筛选稻瘟菌T-DNA插入突变体库的办法,获得了一个菌丝生长明显变慢,孢子产量显著降低的突变体。进一步分析确定T-DNA插入位点位于已报道的稻瘟菌ERD2基因启动子区域,于是我们将插入破坏的基因命名为MoErd2,并对其进行了敲除分析。通过电子显微镜观察发现,MoErd2敲除体形成巨大的液泡。通过泛素化酵母双杂交分离出了 18个可能与MoErd2互作的蛋白。在此基础上,作者在本研究中对MoErd2在稻瘟菌中的作用机理展开了深入研究,并取得了如下主要结果。首先,为了探究稻瘟菌MoErd2与酵母ERD2是否具有相似的功能,作者将稻瘟茵MoErd2基因导入酵母ERD2突变体中,发现稻瘟菌MoErd2能够互补酵母ERD2突变体的表型。为了深入解析MoErd2的功能,作者构建了MoErd2-GFP融合载体,并将其导入MoErd2敲除体中,发现自身启动子驱动的MoErd2-GFP能够完全互补MoErd2敲除体的表型缺陷。显微镜观察显示,融合蛋白MoErd2-GFP与羧基末端具有HDEL的蛋白共定位在内质网。此外,作者还发现,在MoErd2敲除体中,羧基末端具有HDEL基序的蛋白定位于液泡中,而不是像野生型菌株那样定位于内质网中。结合前期电子扫描显微镜观察结果,作者推测,MoErd2可能参与调控细胞自噬。为此,作者比较分析了自噬标记蛋白 GFP-MoATG8在野生型P131和MoErd2敲除体中的定位及积累情况。结果显示,在正常培养条件下,MoErd2敲除体中的GFP-MoATG8围绕在液泡周围累积;在MM-N诱导条件下,MoErd2敲除体中的GFP-MoATG8不能定位于液泡中。同时,在正常培养条件下,MoErd2敲除体中的GFP-MoATG8降解水平显著增加。以上结果说明,MoErd2参与调控稻瘟菌细胞自噬。为了揭示MoErd2在稻瘟菌体内作用的机理,作者对前期分离出的、可能与MoErd2互作的部分蛋白的功能展开了后续研究。通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验,作者发现MoErd2与Mps1存在直接相互作用。在本研究中,作者发现自身启动子驱动的Mps1-GFP能够完全互补Mps1敲除体的表型缺陷,并且定位在内质网。作者同时将Mps1-GFP导入到MoErd2敲除体中,发现Mps1在MoErd2敲除体中定位于液泡,说明Mps1定位在内质网依赖于MoErd2。Western blot 比较显示,在MM-N诱导条件下,MoErd2敲除体中磷酸化的Mps1蛋白积累量显著低于野生型。此外,在Mps1敲除体中,GFP-MoATG8的分解水平明显高于野生型,作者推测Mps1是细胞自噬的负调控因子。基于以上结果,作者认为,MoErd2通过调节Mps1的内质网定位及其磷酸化来调控细胞自噬。为了进一步探究Mps1的磷酸化对稻瘟菌生物学功能的影响,作者对Mps1关键磷酸化位点进行了突变分析。实验结果显示,Mps1磷酸化位点突变后会导致稻瘟菌的产孢量和致病力显著低于野生型。显微观察发现,Mps1磷酸化位点突变后,稻瘟菌能够侵入大麦表皮,但是侵染菌丝的扩展受到抑制。由此说明Mps1的磷酸化影响稻瘟菌的孢产孢及致病力。此外,作者还就另外两个与MoErd2互作的蛋白MEI1和DCR1开展了部分研究工作。共定位观察及泛素化酵母双杂交实验证明,MEI1和DCR1均定位在内质网,并分别能与MoErd2相互作用;进一步深入研究发现,MEI1和DCR1定位在内质网同样依赖于MoErd2。综上所述,本研究首次发现稻瘟病菌MoErd2蛋白介导了多个没有典型内质网定位信号蛋白的内质网定位,并发现这些蛋白通过参与调控稻瘟病的细胞自噬而在稻瘟病菌的致病过程发挥重要作用。同时,还发现MoErd2介导了稻瘟病菌多个致病相关的信号途径。这些结果为更加全面地了解ERD2以及内质网蛋白功能提供新的视角,为深入揭示稻瘟病菌的致病机理,尤其是效应蛋白的分泌机理,提供了新思路。