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真菌毒素是一类由真菌所产生的次级代谢产物，由于其具有较强的毒性，且广泛污染于食品，农作物，饲料等，严重危害人体健康，因此备受关注。近年来的研究显示，真菌毒素也在很多中药材中被检出，这使得中药材的质量和临床用药安全都受到一定的影响。其中，黄曲霉毒素是目前已发现的真菌毒素中毒性最强的一类，已被国际癌症研究机构(IARC)定义为Ι致癌物，因此关于中药材中黄曲霉毒素的污染研究报道最多。然而目前大多研究仅针对中药材中真菌毒素的污染情况，很少对其污染成因进行探究。由于缺乏对其污染途径的了解，因此尚无法做到通过防控环节消除真菌毒素对中药材的污染。由此可知，对常见中药材中真菌毒素进行定量检测、污染来源和防控环节的研究显得尤为重要。本研究以极易污染黄曲霉毒素的动物类中药材土鳖虫为研究对象，开展了黄曲霉毒素的检测方法建立，黄曲霉毒素的污染来源研究，污染主要影响因素确证及防控环节初探，以期为土鳖虫黄曲霉毒素污染的靶向防控提供科学依据；此外还建立了土鳖虫中黄曲霉毒素与其他真菌毒素同步污染的检测方法，可为后续土鳖虫中黄曲霉毒素与其他多种真菌毒素联合污染的研究提供技术手段。主要研究工作如下：
1、建立IAC-HPLC-FLD方法同时测定土鳖虫中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,M1,M2
通过建立免疫亲和柱净化光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法测定土鳖虫中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2的污染情况。采用CloversilC18column色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)进行分离，以甲醇-乙腈-水(20∶20∶60)为流动相，等度洗脱，荧光检测器激发波长λex=360nm，发射波长λem=450nm，流速为0.8mL·min-1，色谱柱温度为30℃。样品通过免疫亲和柱净化后，在上述色谱条件下，呈现良好的回收率，回收率为75.47%~101.8%，RSD值均低于6.7%。本章节实验共检测土鳖虫样品20批次，根据《中国药典》(2015版，一部)中黄曲霉毒素B1限量小于5μg·kg-1，黄曲霉毒素总量(黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2)不超过10μg·kg-1作为参考，有10批次样品检出为阳性，检出率为50.0%，7批次样品超标，超标样品占阳性样品的比率高达70.0%。其中有3批次样品同时检出含有黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2，有1批次检出含有黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1。实验结果表明，此方法适用于土鳖虫中6种黄曲霉毒素的同时检测，且提示对于其易污染黄曲霉毒素的情况应高度重视。
2、市售土鳖虫中黄曲霉毒素污染来源分析
采用已经建立的IAC-HPLC-FLD法检测从药材市场上收集到的51批次土鳖虫中黄曲霉毒素(AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2)的污染情况。将所测定的市售土鳖虫中的阳性样品进行解剖，分别检测其虫体本身、腹部食物残渣、水分含量、水分活度和对阴性样品进行“反式”培养来寻找污染黄曲霉毒素的可能途径。结果表明，在51批次土鳖虫样品中，检测到20批次样品污染了黄曲霉毒素。根据2015版《中国药典》一部中的规定，土鳖虫污染的阳性率为39.21%，超标样品占总样品的23.53%，且超标样品占阳性样品的60.00%。通过对阳性样品进行虫体分离，分别检测其腹部食物残渣与虫体本身，发现腹部食物残渣中的黄曲霉毒素含量高于虫体，而被黄曲霉毒素污染的土鳖虫样品中的水分含量也较高。此外，利用主动侵染黄曲霉菌的“反式”培养方法来考察土鳖虫表面是否易污染黄曲霉毒素，发现经过“反式”培养的土鳖虫表面无明显黄曲霉菌产生，且未有黄曲霉毒素检出，这可能因为土鳖虫外壳坚硬紧密，所以黄曲霉菌在土鳖虫虫体表面的侵染能力降低，由此反向证明了内部食物残渣是土鳖虫污染黄曲霉毒素的主要来源之一。综上所述，土鳖虫的腹部食物残渣和水分含量可能是市售土鳖虫黄曲霉毒素污染的主要因素。
3、土鳖虫黄曲霉毒素污染主要影响因素确证与防控环节探究
根据前一章节中发现土鳖虫中黄曲霉毒素的污染的主要来源是水分含量和其腹部食物残渣，所以本章节针对其干燥方式和“禁食方式”来进一步确证黄曲霉毒素污染的主要影响因素，初步探究防控黄曲霉毒素污染的主要环节。结果表明，在自然条件下干燥的土鳖虫中水分含量超过《中国药典》(2015版一部)中对药材水分含量规定的标准，且发现其在储存30天后呈轻微霉变现象，同时伴随AFB1检出，尽管检出量低于定量限(S/N=10)，而不同烘干方式下样品的水分均未超出《中国药典》中对药材水分含量规定的标准；在研究“禁食方式”时发现，正常饲养下不禁食的样品组别在放置第15天就已经开始有明显腥臭味，而且在第20天时的检测结果中已经检出有黄曲霉毒素污染，其污染程度未超出《中国药典》中对黄曲霉毒素的限量规定，而在相同的放置条件与时间下，禁食的组别中均未有黄曲霉毒素检出，这一实验结果也提示我们需要规范化的样品采收加工过程，以及重视在土鳖虫药材饲养期间食物的来源，从源头最大限度降低土鳖虫的黄曲霉毒素污染风险。
4、建立了QuEChERS-LC-MS/MS法同时测定土鳖虫中15种真菌毒素
通过对样品前处理方法进行考察和UPLC-MS/MS条件的优化，建立了可同时检测土鳖虫样品中包括黄曲霉毒素在内的15种常见真菌毒素(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、T-2毒素、HT-2毒素、青霉酸(PA)、杂色曲霉毒素(ST)、交链孢粉(AOH)、交链孢粉甲醚(AME)、玉米赤霉烯酮(ZEN))污染水平的方法。结果显示各毒素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.9991，检测限浓度为0.0132~0.125ng·mL-1，定量限浓度为0.0264~0.25ng·mL-1，平均回收率为71.37~96.60%，该方法灵敏度高、检测时长短，适用于土鳖虫药材中的多种真菌毒素同时检测，可为后续研究土鳖虫中黄曲霉毒素与其他多种真菌毒素联合污染的状况提供技术手段。
1、建立IAC-HPLC-FLD方法同时测定土鳖虫中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2,M1,M2
通过建立免疫亲和柱净化光化学衍生高效液相色谱-荧光检测法测定土鳖虫中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2的污染情况。采用CloversilC18column色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)进行分离，以甲醇-乙腈-水(20∶20∶60)为流动相，等度洗脱，荧光检测器激发波长λex=360nm，发射波长λem=450nm，流速为0.8mL·min-1，色谱柱温度为30℃。样品通过免疫亲和柱净化后，在上述色谱条件下，呈现良好的回收率，回收率为75.47%~101.8%，RSD值均低于6.7%。本章节实验共检测土鳖虫样品20批次，根据《中国药典》(2015版，一部)中黄曲霉毒素B1限量小于5μg·kg-1，黄曲霉毒素总量(黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2)不超过10μg·kg-1作为参考，有10批次样品检出为阳性，检出率为50.0%，7批次样品超标，超标样品占阳性样品的比率高达70.0%。其中有3批次样品同时检出含有黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2，有1批次检出含有黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1。实验结果表明，此方法适用于土鳖虫中6种黄曲霉毒素的同时检测，且提示对于其易污染黄曲霉毒素的情况应高度重视。
2、市售土鳖虫中黄曲霉毒素污染来源分析
采用已经建立的IAC-HPLC-FLD法检测从药材市场上收集到的51批次土鳖虫中黄曲霉毒素(AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2)的污染情况。将所测定的市售土鳖虫中的阳性样品进行解剖，分别检测其虫体本身、腹部食物残渣、水分含量、水分活度和对阴性样品进行“反式”培养来寻找污染黄曲霉毒素的可能途径。结果表明，在51批次土鳖虫样品中，检测到20批次样品污染了黄曲霉毒素。根据2015版《中国药典》一部中的规定，土鳖虫污染的阳性率为39.21%，超标样品占总样品的23.53%，且超标样品占阳性样品的60.00%。通过对阳性样品进行虫体分离，分别检测其腹部食物残渣与虫体本身，发现腹部食物残渣中的黄曲霉毒素含量高于虫体，而被黄曲霉毒素污染的土鳖虫样品中的水分含量也较高。此外，利用主动侵染黄曲霉菌的“反式”培养方法来考察土鳖虫表面是否易污染黄曲霉毒素，发现经过“反式”培养的土鳖虫表面无明显黄曲霉菌产生，且未有黄曲霉毒素检出，这可能因为土鳖虫外壳坚硬紧密，所以黄曲霉菌在土鳖虫虫体表面的侵染能力降低，由此反向证明了内部食物残渣是土鳖虫污染黄曲霉毒素的主要来源之一。综上所述，土鳖虫的腹部食物残渣和水分含量可能是市售土鳖虫黄曲霉毒素污染的主要因素。
3、土鳖虫黄曲霉毒素污染主要影响因素确证与防控环节探究
根据前一章节中发现土鳖虫中黄曲霉毒素的污染的主要来源是水分含量和其腹部食物残渣，所以本章节针对其干燥方式和“禁食方式”来进一步确证黄曲霉毒素污染的主要影响因素，初步探究防控黄曲霉毒素污染的主要环节。结果表明，在自然条件下干燥的土鳖虫中水分含量超过《中国药典》(2015版一部)中对药材水分含量规定的标准，且发现其在储存30天后呈轻微霉变现象，同时伴随AFB1检出，尽管检出量低于定量限(S/N=10)，而不同烘干方式下样品的水分均未超出《中国药典》中对药材水分含量规定的标准；在研究“禁食方式”时发现，正常饲养下不禁食的样品组别在放置第15天就已经开始有明显腥臭味，而且在第20天时的检测结果中已经检出有黄曲霉毒素污染，其污染程度未超出《中国药典》中对黄曲霉毒素的限量规定，而在相同的放置条件与时间下，禁食的组别中均未有黄曲霉毒素检出，这一实验结果也提示我们需要规范化的样品采收加工过程，以及重视在土鳖虫药材饲养期间食物的来源，从源头最大限度降低土鳖虫的黄曲霉毒素污染风险。
4、建立了QuEChERS-LC-MS/MS法同时测定土鳖虫中15种真菌毒素
通过对样品前处理方法进行考察和UPLC-MS/MS条件的优化，建立了可同时检测土鳖虫样品中包括黄曲霉毒素在内的15种常见真菌毒素(黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素M2、赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、T-2毒素、HT-2毒素、青霉酸(PA)、杂色曲霉毒素(ST)、交链孢粉(AOH)、交链孢粉甲醚(AME)、玉米赤霉烯酮(ZEN))污染水平的方法。结果显示各毒素在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.9991，检测限浓度为0.0132~0.125ng·mL-1，定量限浓度为0.0264~0.25ng·mL-1，平均回收率为71.37~96.60%，该方法灵敏度高、检测时长短，适用于土鳖虫药材中的多种真菌毒素同时检测，可为后续研究土鳖虫中黄曲霉毒素与其他多种真菌毒素联合污染的状况提供技术手段。