天然产物一直是新药发现的源泉,而酶是药物筛选的重要靶标,许多疾病如艾滋病、肿瘤、癌症、高血压、老年痴呆症等的药物都是各种酶的抑制剂。在药物的高通量筛选中,试剂成本大约占所有筛选费用的四分之三,将筛选技术微型化可大大降低筛选成本。毛细管电泳(CE)具有分离效率高,分析速度快,消耗试剂少等优点,可作为酶抑制剂的高效筛选平台。用合适的固载化酶方法,使酶分子自组装在毛细管柱头,形成毛细管固定化酶微反应器,结合CE法在线研究酶反应动力学和抑制动力学,既可减小试剂消耗量,又简化测试步骤,实现酶抑制剂的高通量筛选。具体筛选步骤为：将待筛选的天然产物粗提物与底物混合后进样,使其在酶微反应器中充分反应,然后用CE法测定产物峰面积(或峰高),对照仅底物进样时的产物峰面积(或峰高),计算出其抑制程度,判断待筛选的粗提物中是否存在已知酶的抑制剂。该筛选方法简单易行、自动化程度高,可望用于天然产物粗提物中酶抑制剂的高通量筛选。在前人研究的基础上,本文制备了两种毛细管固定化酶微反应器,结合毛细管电泳法研究了酶促动力学和酶抑制动力学,并成功在线筛选了天然产物粗提物中酶抑制剂。本文主要涉及以下两个部分的工作：(1)成功制备了一个毛细管固定化乙酰胆碱酯酶(AChE)微反应器,结合CE技术,研究了固定化乙酰胆碱酯酶的酶促动力学和酶抑制动力学,并对天然产物中酶抑制剂进行在线筛选。NaOH活化后的毛细管导入一段约2.9cm长的聚阳离子溶液(聚乙烯亚胺),使此段毛细管带上正电荷,然后带负电荷的酶溶液通过静电作用吸附在此段毛细管内壁上,再通过海藻酸钙凝胶作用及壳聚糖的成膜作用在AChE表面上形成一层生物覆膜,于毛细管进样端形成一段大约2.9cm长的固定化AChE微反应器。毛细管剩余部分作为AChE酶促反应产物和未反应完的底物的分离通道,采用产物的峰面积作为定量标准来研究AChE的酶促反应动力学及其抑制动力学。10mmol L-1底物(无抑制剂或存在抑制剂)导入微反应器中,37℃下孵化2min,以20mmol L-1Tris-HCl (pH8.0)为分离缓冲溶液,在分离电压25kV、分离温度37℃的条件下,产物和底物3min内实现完全分离。对影响固定化AChE酶活性的各种因素,如缓冲溶液类型及浓度、孵化时间、底物浓度等条件进行了优化选择。在最优条件下,测定固定化AChE的米氏常数Km、对抑制剂石杉碱甲的抑制动力学常数Ki及半数抑制浓度IC50依次为0.66mmol L-1、0.551μmol L-1、1.52μmol L-1。所建立的方法简单、高效、可靠,成功用于由两种已知的AChE抑制剂和30种天然产物组成的化合物库的抑制剂筛选。(2)成功地制备了一个毛细管固定化胰蛋白酶微反应器,结合毛细管电泳法,研究了固定化胰蛋白酶的酶促反应动力学及抑制动力学,对天然产物中该酶抑制剂进行了在线筛选。经NaOH、 HCl、二次蒸馏水、甲醇依次预处理过的毛细管,真空吹干并升温至40℃,然后导入约1.0cm长的3-氨丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液,充分反应后再导入等长度的戊二醛溶液,反应完毕后再导入等长度的胰蛋白酶溶液,25℃下充分交联,形成一个约1.0cm长的固定化胰蛋白酶微反应器。毛细管剩余部分作为胰蛋白酶酶促反应产物和未反应完的底物的分离通道,采用产物的峰高作为定量标准来研究胰蛋白酶的酶促反应动力学及其抑制动力学。10mmol L-1底物(无抑制剂或存在抑制剂)导入微反应器中,37℃下孵化2min,以50mmol L-1Tris-HCl (pH8.0)作为分离缓冲溶液,在分离电压25kV、分离温度37℃的条件下,产物和底物3.5min内实现完全分离。影响产物、底物的分离和固定化胰蛋白酶活性的各种因素,如缓冲溶液类型及浓度、pH值、分离电压、孵化时间及温度、底物浓度等条件进行了优化选择。在最优条件下,测定固定化胰蛋白酶的米氏常数Km、对抑制剂苯甲脒盐酸盐的抑制动力学常数Ki及半数抑制浓度IC50依次为3.16mmol L-1、12.9mmol L-1、3.98mmol L-1。该方法简单、高效、可靠,成功用于从19种天然产物粗提物中筛选胰蛋白酶的抑制剂。