钙化性主动脉瓣疾病（Calcific Aortic Valve Disease,CAVD）是当今最常见的心血管疾病之一,给临床治疗和社会经济带来了巨大的负担。随着研究的深入,人们发现CAVD不仅是瓣膜退行性变与钙盐沉积导致的后果,其病变的病理过程还涉及内皮损伤、细胞分化、脂质浸润、慢性炎症、基质重塑、进展性钙化及新生血管形成等复杂变化的主动过程,细胞间的转化及一些基因的变异在其发生发展中也扮演重要角色。内皮间质转化（Endothelial-mesenchymal transition,EndoMT）在胚胎期心血管系统的发育、心脏纤维化、动脉粥样硬化和肺动脉高压等方面发挥着重要的病理生理作用,主动脉瓣内皮细胞（Valvular Endothelial Cells,VECs）在CAVD中也发生了向瓣膜间质细胞（Valvular Interstitial Cells,VICs）的表型和功能转变。然而,关于这一领域存在几个挑战,包括缺少对EndoMT在整个疾病过程中变化趋势的描述;缺乏完整准确的EndoMT定义,依靠传统方法无法识别已经发生完全EndoMT的细胞;以及无法追踪研究发生了 EndoMT的细胞功能与发病机制。因此,利用人病变标本和CAVD动物模型详细描述EndoMT在钙化性瓣膜病发生发展过程中的表达;改进造模周期过长的传统CAVD动物模型并结合遗传谱系示踪技术追踪瓣膜内皮细胞在疾病过程中的变化,进一步探究发生部分与完全EndoMT细胞的功能;分析挖掘CAVD患者瓣膜样本测序数据,并用传统分子生物学实验技术研究可能影响EndoMT和CAVD的关键靶点基因,对于明确EndoMT在钙化性瓣膜病中的作用具有十分重要的意义,也为疾病的预防干预提供新的策略。既往研究多局限于组织样本层面和体外细胞实验,还没有研究利用在体CAVD动物模型去研究EndoMT在CAVD疾病进展早期与晚期的表达与作用。所以本研究第一部分构建了兔和小鼠的CAVD动物模型,分别在疾病过程的不同时期进行主动脉瓣标本取材和观察,最后结合人源主动脉瓣钙化样本,在病理及分子层面验证CAVD病程中EndoMT的表达。第一部分构建了传统的动物模型并观察了疾病过程中EndoMT的表达,然而传统CAVD小鼠模型存在造模时间长,成功率低等问题,所以本研究结合高脂小鼠模型和导丝损伤小鼠模型的经验,开发构建与临床病程更相符且造模周期短、成功率高、一致性好的CAVD小鼠模型。学界中对EndoMT在CAVD过程中的作用仍存在争议,遗传谱系示踪技术是研究发育和疾病过程中细胞来源、转化、分化的最直接强力的证据,因此,本研究又建立了内皮细胞谱系示踪小鼠,并结合之前的CAVD动物建模方法,初步观察了瓣膜内皮细胞在谱系示踪小鼠病变过程中的命运及转化。目前尚无非手术方法预防或治疗钙化性主动脉瓣疾病,这在很大程度上是因为我们对疾病机制的了解有限。前两部分的研究发现了 EndoMT对CAVD起到一定作用,EndoMT的本质是构成主动脉瓣的两类细胞VECs和VICs的相互作用和转化,本研究的第三部分分析挖掘前期人类钙化瓣膜测序数据,找到了可能干预的钙化关键基因DUSP1和与EndoMT有关的基因PDK4,通过体外实验对两种基因的功能和相关通路进行了研究,结果提示DUSP1可以抑制VICs的钙化,敲低PDK4抑制了VECs的EndoMT过程,为CAVD的治疗提供了新的潜在靶点。第一部分:内皮间质转化在钙化性主动脉瓣膜中的表达背景:钙化性主动脉瓣疾病（CAVD）是世界范围内严重威胁心血管健康的疾病,其发病机制不明。内皮间质转化（EndoMT）在胚胎期主动脉瓣的发育中发挥重要作用,成年后钙化性主动脉瓣疾病的发生发展可能与EndoMT这一过程的重新激活有关。EndoMT可能是CAVD疾病预防和治疗的一个有价值的治疗靶点,本研究拟探讨EndoMT及相关转录因子在不同物种钙化主动脉瓣膜组织中的表达变化。方法:收集临床中钙化瓣膜和正常瓣膜标本做EndoMT现象的验证;构建兔CAVD模型,分别于4周、8周、12周对高脂组及对照组兔主动脉瓣组织进行取材;构建单纯高脂喂养载脂蛋白E敲除（Apolipoprotein E,ApoE-/-）小鼠CAVD模型,分别在8周、16周、20周、24周、28周、32周、36周、40周对小鼠主动脉瓣膜进行取材。改良钙化瓣膜脱钙方法,通过H&E、Masson染色观察瓣膜形态结构;通过茜素红和Von Kossa染色评估瓣膜钙盐沉积情况,通过免疫组化和免疫荧光法检测内皮标志物CD31、VE-cadherin与间质标志物αSMA、vimentin及EndoMT转录因子SNAIL1/2的共定位表达情况。在分子层面分别检测人源和小鼠主动脉瓣标本中与EndoMT相关的RNA表达水平。结果:人和兔的钙化主动脉瓣切片内皮区域有内皮和间质标记物共表达区域;钙化组小鼠瓣膜切片有EndoMT转录因子高表达区域。与正常瓣膜相比,人和小鼠钙化瓣膜中内皮、间质标记及EndoMT相关转录因子在RNA表达水平上存在显著差异。结论:本研究利用人源主动脉瓣样本及兔和小鼠CAVD动物模型样本在病理及分子层面验证了 CAVD中EndoMT现象的存在,并且连续时间点检测小鼠内皮和间质标志物,其变化趋势反映EndoMT随着疾病进程逐渐加重。第二部分:钙化小鼠模型的改良与内皮细胞谱系示踪小鼠模型的构建及其内皮间质转化的表达背景:传统的高脂喂养CAVD小鼠模型造模周期长,出现主动脉瓣的狭窄和钙化的比例不高;而导丝损伤CAVD小鼠模型机械损伤较重,手术难度及死亡率高,且急性损伤模型的病理生理与临床慢性病变过程差别大,需要一种成型时间快,病理过程与临床类似的动物模型。EndoMT在主动脉瓣病变中的作用仍缺少关键性的直接证据,需要特异性内皮细胞谱系示踪小鼠来证明EndoMT在钙化性主动脉瓣疾病中的作用。方法:构建导丝损伤联合高脂喂养ApoE-/-小鼠,并与单纯导丝损伤小鼠对比,分别于4周、8周、12周、16周对模型小鼠进行超声评估并取材,通过H&E、Masson染色观察瓣膜形态结构,通过茜素红染色评估瓣膜钙盐沉积,免疫荧光法检测内皮与间质标志物的共定位表达情况,比较不同模型的造模效果。构建一种内皮特异性表达红色荧光蛋白（Red Fluorescence Protein,RFP）的谱系示踪ApoE-/-小鼠,采用单纯高脂喂养及高脂联合导丝损伤的方法诱导小鼠主动脉瓣钙化。结果:相比单纯高脂喂养和单纯导丝损伤小鼠,导丝损伤联合高脂喂养ApoE-/-小鼠CAVD模型的主动脉流速明显增快,出现钙化时间更早,在8周出现主动脉瓣钙化。成功构建内皮细胞谱系示踪ApoE-/-小鼠,高脂喂养8周后及导丝损伤4周后有a SMA与RFP共定位现象,提示EndoMT现象。结论:导丝损伤联合高脂喂养ApoE-/-小鼠是一种成型快,造模效果好,一致性高的改良CAVD小鼠模型,优化了既往CAVD小鼠动物模型,扩展了其应用,为CAVD的基础研究提供了一种合适可靠的动物模型。本研究首次利用内皮细胞谱系示踪小鼠进行CAVD小鼠建模,为EndoMT在CAVD发病和疾病进展中的作用提供了新的强力证据。第三部分:DUSP1与PDK4在CAVD中的表达及相关机制探究背景:CAVD的发病机制不明,手术与介入仍是其治疗的唯一手段,预防或减缓CAVD进展的非手术治疗的分子机制或靶点仍然难以找寻,需要利用临床样本和动物模型筛选及验证潜在干预靶点。方法:利用人钙化主动脉瓣和正常主动脉瓣的mRNA测序及单细胞转录组测序结果筛选差异基因,结合外部组织验证及文献回顾确定了在钙化组显著下调的2个基因DUSP1和PDK4。利用CAVD小鼠模型组织切片探究DUSP1在主动脉瓣上的时空分布。采集正常主动脉瓣膜用胶原酶法消化获取人原代主动脉瓣间质细胞（VICs）,用磁珠法分选获取主动脉瓣内皮细胞（VECs）。对VICs促钙化培养后在不同时间点检测DUSP1、PDK4及相关钙化标记物的变化趋势。利用siRNA抑制DUSP1的表达后检测其对VICs成骨转化过程的影响。利用腺病毒载体对VECs进行PDK4的过表达及敲低后用TGF β诱导VECs发生EndoMT,检测转染后细胞内皮、间质标记及EndoMT转录因子的变化情况。结果:免疫荧光染色提示DUSP1主要分布于主动脉瓣的心室侧;连续7天观察促钙化培养后VICs的DUSP1及PDK4变化趋势,发现DUSP1早期显著上升,后期下调,PDK4早期显著下调后持续下调。siRNA抑制DUSP1后BMP2表达上调,3天后茜素红染色与对照组相比着色较深,茜素红定量有显著差异;腺病毒过表达PDK4后促进VECs的EndoMT,敲低PDK4后抑制TGF β诱导VECs的EndoMT。结论:敲低DUSP1加速VICs的钙化,过表达PDK4后促进VECs的EndoMT,敲低PDK4可以抑制TGF β诱导VECs的EndoMT过程。体外实验提示DUSP1对VICs的钙化有保护作用,敲低PDK4抑制了 VECs的EndoMT过程,为以后针对EndoMT的干预及预防治疗CAVD的药物研究提供靶点。