第一部分 头孢曲松耐药淋球菌的分子生物学研究第一节 头孢曲松耐药淋球菌临床分离株的基因分型[目的]头孢曲松是淋病治疗时最后的一线经验性药物。本研究对中国常规淋球菌耐药监测中发现的头孢曲松高水平耐药的BJ16148克隆,进行基因分型研究。[方法]采用纸条梯度扩散法检测该头孢曲松耐药株,对阿奇霉素、大观霉素、四环素、环丙沙星和头孢克肟的最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentratio n,MIC）,同时使用淋球菌多抗原测序分型、多位点测序分型和淋球菌耐药位点测序分型进行基因型别的鉴定。[结果]此头孢曲松MIC为0.5mg/L的BJ16148菌株,阿奇霉素的MIC为0.25mg/L,大观霉素的MIC为16mg/L,四环素的MIC为4mg/L,环丙沙星的MIC为>32mg/L,头孢克肟的MIC为lmg/L。经过分子分型鉴定,多抗原测序分型为3435型,多位点测序分型为1903型,淋球菌耐药位点测序分型为233型,其中头孢曲松耐药相关的penA基因为60型。[结论]本研究发现的头孢曲松高水平耐药的淋球菌菌株与2015年日本发现的头孢曲松耐药的FC428克隆同源。第二节 头孢曲松耐药淋球菌克隆的检测技术建立[目的]目前在全球多个地区已发现了同一型别的头孢曲松耐药株,本研究建立一种能快速识别此耐药淋球菌克隆的分子检测方法。[方法]采用实时荧光PCR的原理,针对淋球菌porA和penA两段基因上的特定序列进行检测技术的建立开发,并验证和评估双检方法的可行性和检测限。[结果]本研究建立的双检方法可检测出相应的基因片段,对淋球菌和头孢曲松耐药克隆的检测限约为160拷贝/反应。[结论]本研究建立了一种能同时检测淋球菌和全球传播的头孢曲松耐药克隆快速的双检方法。此方法有较好的检测效能,可开展下一步的评测实验。第三节 头孢曲松耐药克隆的分子检测方法的比较[目的]比较四种针对头孢曲松耐药克隆的分子检测方法的准确性和临床适用场景。[方法]根据文献的描述,分别建立检测耐药流行株的普通探针法,锁核酸（Locked Nucleic Acid,LNA）探针法和高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting,HRM）法。选取国内已发现的18例阳性样本和分属不同penA基因型别的51例阴性样本,评估四种检测方法的准确性。[结果]四种方法的敏感性都为100%。探针方法检测阴性样本时,LNA探针法产生较多假阳性结果,普通探针法次之,双检方法中未出现假阳性。HRM法中,所有阳性样本的熔解温度介于78.25℃至78.95℃,小于阴性样本最低的熔解温度79.35℃,可将熔解温度设定为79℃以区分头孢曲松耐药克隆。[结论]四种方法都能较准确的检测出全球传播的头孢曲松耐药的淋球菌克隆。在大批量筛查检测时推荐采用HRM法,在临床快速检测时推荐采用双检方法。第二部分 淋球菌对庆大霉素的药物敏感性监测第一节 大连地区淋球菌对庆大霉素敏感性的初步研究[目的]在淋球菌耐药形势严峻的背景下,为了提供一种新的治疗选择,本研究初步检测了大连地区收集的淋球菌临床分离株的敏感性特征。[方法]选取2016-2018年,大连市皮肤病医院收集的120株淋球菌临床分离株,采用琼脂稀释法测定对庆大霉素的最低抑菌浓度。用Kruskal-Wallis H检验统计3年间的MIC是否存在差异。[结果]120株淋球菌中未发现对庆大霉素耐药的分离株,其中103株（85.8%）对庆大霉素敏感（MIC≤4mg/L）,17株（14.2%）对庆大霉素中敏（MIC为8mg/L）。3年间的淋球菌菌株对庆大霉素的MIC变化无统计学意义。[结论]大连地区收集的淋球菌临床分离株,对庆大霉素的敏感性较高,且不随年份变化。可扩大样本量检测,以了解庆大霉素在我国的临床应用潜力。第二节 中国淋球菌对庆大霉素敏感性的横断面研究[目的]本研究评估我国的淋球菌临床分离株,对庆大霉素的敏感性,以及庆大霉素和与头孢曲松、阿奇霉素和大观霉素等抗生素的药敏状态之间的关系。[方法]本研究采用琼脂稀释法,检测了中国7个省或直辖市的470株淋球菌临床分离株,对四种抗生素的最低抑菌浓度,并分析不同药物敏感性之间的关联。[结果]庆大霉素的MIC介于1mg/L至8mg/L,未发现耐药株。19（4.0%）株对头孢曲松耐药,73（15.5%）株对阿奇霉素耐药。7株淋球菌同时对头孢曲松和阿奇霉素耐药,其中6株对庆大霉素敏感性高。庆大霉素的MIC和各抗生素的耐药状态之间不存在关联。[结论]体外药物敏感性研究发现我国淋球菌对庆大霉素的敏感性较高,可开展下一步的临床试验以评估治疗效果。此外,我国淋球菌对一线治疗用药头孢曲松和（或）阿奇霉素的敏感性逐渐降低,亟需监测敏感性变化情况。