论文部分内容阅读
尼卡巴嗪是一种全球公认的化学合成类抗球虫老药,是由等摩尔HDP、DNC复合而成的氧化磷酸化解偶联剂,作用峰期在球虫感染后第4d,主要作用于第二代裂殖生殖期,目前主要作饲料添加剂用于鸡球虫病的预防。由于尼卡巴嗪影响母鸡繁殖性,对雏鸡有潜在的生长抑制效应、增强鸡热应激等不良作用,以及在禽肉、蛋中残留而危害人体健康,各国均制定了禽类产品中的尼卡巴嗪最高残留限量或规定不得在进出口禽类食品中检出。免疫分析技术以其特异、敏感、简便、快速等优点已广泛用于兽药残留的快速检测,但目前我国动物源性食品中尼卡巴嗪的残留检测技术主要为色谱技术,其不但费时、繁琐,且操作过程中使用大量有机溶剂而污染环境和危害人类健康。本研究应用人工完全抗原合成和单克隆抗体、多克隆抗体制备技术,建立了分泌尼卡巴嗪单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并用多克隆抗体建立了检测尼卡巴嗪阻断ELISA检测方法,为禽类产品中尼卡巴嗪的快速检测提供了新的技术。人工抗原合成、小鼠免疫及间接ELISA方法的优化:用碳化二亚胺方法偶联免疫抗原PNA-BSA和检测抗原PNA-OVA,分别经过SDS-PAGE鉴定偶联成功后免疫Balb/c小鼠,200μg·只-1,共免疫5次获得高免血清,建立并优化了间接ELISA法,得到最佳反应条件是: 8.33μg·mL-1抗原经碳酸盐缓冲液包被37℃1h,4℃过夜,1%脱脂奶封闭90min,1:4000血清作用60min, 1:5000酶标二抗作用60min,底物作用15min,平均批内重复试验CV为2.1%,平均批间重复试验CV为2.4%,均小于15%,表明该方法重复性良好。用优化的ELISA方法检测免疫小鼠血清效价为1.28×104,可以用于单克隆抗体制备。酶标抗原PNA-HRP的合成与鉴定:采用碳化二亚胺法将半抗原PNA与辣根酶HRP偶联,Sephadex G-25层析纯化后鉴定,结果:紫外分光光度计表明收集的样品洗脱峰比较明显,2号管及3号管在280nm和405nm处吸收峰较高;SDS-PAGE鉴定结果表明HRP-PNA偶联成功;UV鉴定结果显示偶联后HRP-PNA波峰与HRP波峰叠加并发生位移,表明偶联成功;酶标抗原稀释至2560倍时仍具活性,证明该偶联方法可靠,为竞争ELISA检测方法的建立奠定了基础。抗尼卡巴嗪杂交瘤细胞株的制备与鉴定:取免疫阳性Balb/c小鼠脾脏,在PEG2000作用下,将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,间接ELISA法筛选阳性孔细胞,3次有限稀释法亚克隆培养,经过数次传代后,获得2株分泌抗尼卡巴嗪的杂交瘤细胞株,分别命名为2A8、2F5。小鼠腹水效价为1:6400,2株单抗的染色体数目均在95-98之间。兔多抗血清的制备、阻断ELISA方法的建立及优化:用人工合成的完全抗原PNA-BSA背部分点注射免疫家兔,抗原量为1 mg·kg-1,共免疫4次,获得高免血清,用间接ELISA法检测兔血清效价,其中3只家兔血清效价达1:12800;选择效价最高的3号家兔血清作阳性血清建立并优化阻断ELISA法;优化后最佳反应条件为抗原包被浓度4.165μg·mL-1,血清稀释浓度1:3200,酶标二抗工作浓度1:1000。兔多抗血清的鉴定:利用建立的阻断ELISA法检测尼卡巴嗪与兔多克隆抗体的敏感性,标准曲线的回归方程为y=-14.220x+31.693, R2=0.995。尼卡巴嗪多抗对尼卡巴嗪的半数抑制浓度IC50为47.53ng·mL-1,检测限为0.00410μg·mL-1。与磺胺氯丙嗪钠、妥曲珠利、盐酸氨丙啉、磺胺喹恶啉钠、磺胺间甲氧嘧啶钠等5种抗球虫药无交叉反应性,特异性好。本研究为商品化试剂盒的组装奠定了基础。本试验制备抗尼卡巴嗪单克隆抗体、多克隆抗体、并建立及优化ELISA检测方法为动物源性产品中尼卡巴嗪快速检测提供了新方法和新手段。