鱼类神经坏死病病毒衣壳蛋白基因分析及其真核表达

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鱼类病毒性神经坏死病(virus nervous necrosis,VNN)的病原为鱼类神经坏死病毒,它属于诺达病毒科(Nodaviridae)中的β-诺达病毒属。自80年代报道以来,目前该病毒引起的疾病在除非洲以外的世界其它地方迅速蔓延开来,给各国海水养殖业造成了巨大的损失。神经坏死病毒基因组包括两条正义的、非聚腺苷酸化的RNA单链(RNA1和RNA2)。RNA1的大小约为3.0 kb-3.2 kb,主要编码非结构A蛋白,是一种依赖RNA的RNA聚合酶;RNA2的大小约为1.3 kb-1.4 kb,其开放阅读框编码一个病毒衣壳蛋白。近年来我国沿海大规模网箱养殖的石斑鱼,由于受神经坏死病毒的感染,给育苗生产带来极大的损失。从本室分离到的6株NNV提取病毒基因组RNA。根据已报道的RNA2片断全序列设计引物,用RT-PCR方法特异性扩增出6株病毒的衣壳蛋白基因片段,分别连接到PMD18-T载体中,并进行序列测定和分析。结果发现,6个NNV分离株的RNA2片断核苷酸序列的同源性在97.3%以上;推导的氨基酸序列同源性在79.6%-99.1%之间。根据RNA2片断核苷酸序列绘制的分子进化树表明,6个NNV分离株在进化树同一分枝上,属于RGNNV基因型,与已报道的点带石斑鱼神经坏死病病毒(ECNNV)、巨石斑鱼神经坏死病病毒(ETNNV)及玛拉巴石斑鱼神经坏死病病毒(MGNNV)亲缘关系较近。试验结果表明,我国沿海养殖场发生的鱼类病毒性神经坏死病均由同一来源的病毒引起的,该基因型的鱼类神经坏死病毒在我国沿海养殖的石斑鱼中传播流行。利用RT-PCR技术获得病毒性神经坏死病毒0603株的衣壳蛋白基因,将其插入到杆状病毒Bac-To-Bac表达系统的pFastBacⅠ质粒中,构建了pFastBac-cp质粒,转化DH10Bac大肠杆菌后获得重组穿梭载体Bacmid-cp,脂质体介导转染Sf9细胞产生有感染力的重组杆状病毒AcNPV-cp。SDS-PAGE,ELISA和Western-blotting分析可见大小约为37kD的特异性蛋白带,其可以与病毒性神经坏死病毒阳性血清反应,表明AcNPV-cp在Sf9细胞中成功地表达了病毒性神经坏死病毒的衣壳蛋白。电镜观察发现,cp蛋白可自行装配成病毒样粒子,其大小形态类似全病毒,并呈晶格状排列在细胞质中。
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