基于Ser-SELEX技术的胃腺癌适配体筛选及其应用研究

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胃癌(Gastric Cancer)作为最常见的恶性肿瘤之一,其高发病率和高死亡率引起了人们的广泛关注。胃腺癌(Gastric Adenocarcinoma,GA)是胃癌病理学分类中最常见的一种,约占胃癌总数的95%。胃腺癌的发病机制目前尚不清楚,患者早期一般无明显症状,待确诊时已发展为中晚期,错过了最佳干预和治疗阶段。胃腺癌的早期诊断和早期治疗对降低发病率和死亡率具有重要意义。核酸适配体是一小段单链DNA或RNA,可通过指数富集配体系统进化技术(The Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)从体外随机ss DNA文库中筛选获得。核酸适配体与抗体相比,其优势有性质稳定、易化学修饰、易体外合成、粒径小、无免疫原性、成本低等,可作为分子探针应用于胃腺癌的早期诊断和治疗,具有广泛应用前景。本研究以琼脂糖羧基磁珠为固定载体,利用Serum-SELEX(Ser-SELEX)技术筛选胃腺癌核酸适配体。通过引入健康人血清和宫颈癌患者血清为反筛靶标,减少文库投入量和胃腺癌患者血清质量,增加筛选压力。经过7轮正向筛选和2轮消减筛选,当文库投入量与胃腺癌患者血清质量比值趋于稳定时,完成筛选,进行高通量测序。经过序列比对和同源性分析,挑选出7条候选核酸适配体(Apt-3、Apt-56、Apt-67、Apt-69、Apt-77、Apt-88、Apt-101)进行后期验证。在适配体序列比对时发现,适配体序列的中间随机区域富含GC碱基,其二级结构多为茎环结构。圆二色谱分析显示,7条候选核酸适配体呈右手螺旋特征。q-PCR法检测了候选核酸适配体对胃腺癌靶标的亲和力,采用Graph Pad Prism 8软件模拟候选核酸适配体浓度梯度与ct值之间的线性关系,结果表明,候选核酸适配体浓度梯度与ct值均呈正相关,亲和力常数为纳摩尔水平,表明候选核酸适配体与靶标有很高的亲和力。利用q-PCR法、量子点标记法(Quantum Dots Labeling)和ELASA法验证了候选核酸适配体识别靶标的特异性,以健康人、宫颈癌、结肠癌和胃癌患者血清做阴性对照组,结果表明,q-PCR法和量子点标记法验证结果均显示Apt-101较Apt-77对靶标亲和力更高,特异性更强,Apt-101的平衡解离常数(Kd值)为6.444±1.128 nM,特异性检测阳性率大于70%。综上所述,利用Ser-SELEX技术筛选胃腺癌核酸适配体结果中,Apt-101对胃腺癌靶标亲和力高、特异性强,达到了筛选目的,在胃腺癌早期诊断和治疗中具有较大应用前景。
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