荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是重要的热带亚热带木本常绿果树,在我国南方广泛栽培。植物碳素营养与作物产量及产品器官品质密切相关,一直以来都是科学界研究的焦点。近年本研究组发现荔枝可溶性碳水化合物中含有大量的肌醇甲醚类物质—白坚木皮醇。白坚木皮醇是2-甲基环己六醇,是具有空间异构特性的手性化合物。白坚木皮醇在荔枝各组织或器官中广泛分别且含量较高。前期研究表明白坚木皮醇在叶片中合成,与光合作用关系密切,是碳水化合物主要运输形式。然而白坚木皮醇的代谢途径和生物学功能仍未有深入的研究。本文着重探究荔枝白坚木皮醇的生物合成途径、代谢去向和荔枝大量积累白坚木皮醇的生物学意义。研究结果有助于深入揭示荔枝碳素代谢途径。主要研究结果如下:1.鉴定了荔枝叶片中新的肌醇甲醚物质,并命名为无患子醇,无患子醇在具备光合能力的叶片中特异积累。本研究在分析荔枝叶片糖组分过程中发现新的可溶性碳水化合物,含量较低,通过HPLC和GC-MS鉴定推断该物质是白坚木皮醇类似物,该物质与现有肌醇甲醚标准品的质谱图相同但出峰时间不一致。由于在HPLC分析时该未知物与白坚木皮醇在色谱柱中无法被有效分离,通过优化回收条件,馏分收集得到白坚木皮醇和未知物的混合物。进一步通过NMR分析,最终鉴定该未知物为1-甲基环己六醇,是白坚木皮醇的空间异构体,为其命名为无患子醇。进一步分析了包括叶片、韧皮部、木质部和愈伤组织的不同荔枝组织或器官糖组分,发现该物质仅在叶片存在,并在叶片成熟过程中逐渐累积。2.成功构建了荔枝叶片病毒诱导的基因沉默实验体系（VIGS）,验证了Lc IMT1基因在催化荔枝肌醇甲醚合成中的功能,并根据该基因沉默后代谢物的变化结合前人的研究进展,提出了植物肌醇甲醚类物质生物合成的可能途径。VIGS在荔枝的生殖器官发挥基因沉默功能已有报道,然而未在叶片成功应用,本研究构建了荔枝盆栽苗的VIGS实验方法,成功沉默了Lc PDS和Lc IMT1基因。荔枝沉默Lc IMT1基因处理后,叶片Lc IMT1基因表达量显著下降,同时发现无患子醇和白坚木皮醇含量显著下降明显,但对蔗糖含量无明显的影响。说明无患子醇和白坚木皮醇是Lc IMT1基因表达催化产物,由于基因沉默对无患子醇的影响大于白坚木皮醇,我们推测无患子醇是Lc IMT1表达蛋白催化的直接产物,Lc IMT1是1-O-甲基肌醇甲基转移酶基因,而无患子醇可能是白坚木皮醇生物合成的前体物质。3.构建了高效的荔枝叶片原生质制备的实验体系。原生质体是植物学研究的重要材料,荔枝由于其叶片革质化严重,富含多糖多酚,极易褐化,原生质体分离困难,本研究改良了原生质体分离液成分,添加了不同的巯基还原物质,发现β巯基乙醇可有效抑制了褐化作用,结合调节渗透势、离子浓度、酶量和酸碱度,获得了大量活性较高的荔枝叶片原生质体,数量可达1010个/ml。4.揭示了白坚木皮醇在荔枝叶片渗透势维持的作用,指出叶片低蔗糖浓度但同样保持高的渗透势是大型乔木荔枝特殊的碳素代谢策略,可能与荔枝高抗和低耗的植物学特征有关。非结构型碳水化合物具有重要生物学功能,白坚木皮醇是荔枝中含量较高的环多元醇,参与长距离运输,对47个荔枝品种蔗糖和白坚木皮醇含量分析,结果显示不同品种荔枝蔗糖和白坚木皮醇含量呈明显的正相关,说明两者在代谢和功能上可能相似。与45个不同物种叶片可溶性糖含量相比,荔枝比绝大部分乔木的蔗糖浓度低,但白坚木皮醇有效补充了蔗糖浓度的不足,维持了荔枝叶片中较高的渗透势。荔枝叶片中碳水化合物与含水量相关分析表明蔗糖和白坚木皮醇与叶片含水量显著相关,说明白坚木皮醇和蔗糖共同参与叶片渗透势调节,保证荔枝叶片的水分摄取能力。5.探索了荔枝中白坚木皮醇的代谢去向,指出莽草酸可能是白坚木皮醇进一步代谢的产物。环多元醇的代谢去向目前还没有报道,肌醇甲醚被认为是代谢相对惰性的物质。本研究发现回收得到的白坚木皮醇和无患子醇混合物常温环境放置长时间后会有明显降解,降解产物为莽草酸,莽草酸与白坚木皮醇同为环状化合物。进一步利用叶片分离的原生质体,在原生质体培养液中添加白坚木皮醇,发现有莽草酸产生,添加甘露醇的对照组莽草酸含量显著低于处理组。对荔枝叶片饲喂13CO2后分析叶片的糖组分,莽草酸含量与白坚木皮醇含量有明显的正相关性,说明莽草酸可能是白坚木皮醇的代谢下游物质。6.探讨了白坚木皮醇饲喂对荔枝原生质体基因表达的影响,指出白坚木皮醇可能与抗病和糖信号转导相关。荔枝叶片原生质培养液中添加白坚木皮醇,培养后进行转录组测序共得到113条有显著差异的Unigene,其中74条可以比对到荔枝基因组数据,33条有基因功能注释。使用添加蔗糖的培养液培养,与白坚木皮醇培养液相比共得到5个基因表达模式与此前的转录组差异基因一致,说明这5个基因特异响应白坚木皮醇。为了进一步确定结果,利用外源生长调节剂处理,研究处理对白坚木皮醇含量、Lc IMT1基因表达以及5个白坚木皮醇响应基因表达的影响,发现NAA处理可以明显增加白坚木皮醇含量,肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶（FKBP）（Litchi＿GLEAN＿10021632）和UDP葡萄糖焦磷酸化酶（Litchi＿GLEAN＿10013948）两个基因表达水平增加。