马尔尼菲篮状菌(Talaromyces marneffei,简称TM)是篮状菌属中唯一的温度依赖性双相真菌,可引起马尔尼菲篮状菌感染,在东南亚和我国南方地区呈地域性分布。患者以HIV感染人群为主,近年来非HIV感染者合并的马尔尼菲篮状菌感染有逐步升高趋势。由于其临床症状和影像学表现缺少特异性,目前马尔尼菲篮状菌感染的实验室检查主要依赖培养或病理组织学诊断,但培养耗时长、灵敏度低,病理组织为创伤性操作不易实施。其他真菌抗原血清学检测缺乏稳定、获批可应用于临床检测的试剂盒,因此导致诊断TM感染时间长,死亡率较高。甘露聚糖蛋白抗原(Mp1p)是TM特异性抗原,表达丰富,可用于TM感染实验室诊断。本实验室前期制备了特异性针对Mp1p的兔多克隆抗体(PAb)和识别不同表位的18株单克隆抗体(MAb),并建立了多抗-单抗配对的双抗体夹心ELISA体系,初步经临床评价具有一定的灵敏度(75%)和特异度(99.4%)。但是否可用于早期检测尚不清晰,而且由于捕获抗体使用兔多克隆抗体,制备时易产生批次差异,因此,本研究我们用单克隆抗体进行多种自由组合,优化后以混合单克隆抗体代替多克隆抗体,建立优化的TM-Mp1p抗原捕获ELISA体系,并对其在TM感染早期诊断中的作用进行探讨。本研究主要包括三部分:第一部分:马尔尼菲篮状菌Mp1p抗原捕获ELISA检测体系的优化本研究在前期制备18株单抗基础上,结合前期实验结果中不同MAb的结合表位分析、间接免疫荧光鉴定MAb与TM细胞结合的强度、免疫组化实验中MAb与感染后组织内TM细胞壁结合强度等结果,将18株MAb中识别不同表位,且与TM天然抗原结合反应强的抗体,进行自由组合进行配对,以选择最佳的混合单抗组合作为捕获抗体,选择其中一株抗体作为检测抗体进行配对,并对包被抗体中各株单抗之间的混合比例、包被浓度、检测抗体浓度等进行优化,建立与原有多抗-单抗体系灵敏度相似或更为灵敏的双抗体夹心ELISA体系。结果显示:以4株特异性单抗(M4、M6、M8和M14)进行混合包被的检测效果最佳,包被浓度10μg/ml,其最佳的包被比例为4:3:2:1,最佳检测抗体仍为M12-Biotin,与原有多抗-单抗配对检测体系的检测抗体相同。检测抗体(M12-Biotin)工作浓度为1:1000稀释,超敏链霉亲和素过氧化物酶聚合物(Streptavidin-HRP)工作浓度为 1:1000。第二部分:双抗体夹心法捕获马尔尼菲篮状菌Mp1p抗原ELISA检测体系优化后性能评价基于前期建立的多抗-单抗配对检测体系,以及第一部分中优化后的混合单抗-单抗配对检测体系,为避免不同分离菌株中Mp1p抗原水平的差异,我们选择4株临床分离TM在不同初始孢子浓度、不同培养时间制备的培养上清,同时检测重组Mp1p,判断两组不同检测体系的灵敏度差异。同时,检测临床感染常见的其他真菌培养上清,判断与其他真菌感染是否存在交叉反应。结果显示:不同临床分离TM菌株分泌Mp1p水平不同,两组检测体系均不能检测到初始培养浓度低于1×105/ml时的培养上清,可能与TM形态转换时低水平分泌Mp1p有关。但优化后体系更敏感,最低可测1×105/ml培养3天的上清。而且检测4株TM培养上清时,优化后的体系检测展示出更高的A450值,并且可检测160倍稀释培养上清,而原有体系仅能检测40倍稀释的培养上清。检测重组蛋白Mp1p梯度稀释液显示,两组体系均能检测至125pg/ml的Mp1p抗原,检测重组蛋白的灵敏度相同。同时两组体系与其他临床常见真菌(白念珠菌、新型隐球菌、烟曲霉、黄曲霉、土曲霉、桔青霉)培养上清无交叉反应,具有相同特异性。第三部分:双抗体夹心法捕获马尔尼菲篮状菌Mp1p抗原ELISA检测体系优化后的初步临床应用评价我们进一步通过对临床血清样品的检测,探讨优化后的检测体系在TM感染早期诊断中的价值。以珠江医院检验医学部收集的202例正常人血清、53例其他真菌感染病人血清(确诊念珠菌感染1例、确诊曲霉感染5例,临床诊断曲霉感染7例,拟诊曲霉感染36例,确诊毛孢子菌感染1例、确诊肺毛霉菌病1例、确诊隐球菌病2例)评价检测体系的特异度,以来自5例确诊TM感染病人的20份血清评价检测体系的灵敏度。结果显示:采用优化后体系和原有体系同时检测10倍稀释的202例正常人血清,确立临界值。进一步检测53例其他真菌感染病人血清验证检测体系的特异性,其检测结果均为阴性,提示与临床常见其他真菌感染无交叉反应,特异度为100%(255/255)。随后检测20份确诊的TM感染病人血清,两个体系的检测结果相同,均有19份为阳性,灵敏度95%(19/20),两组检测体系的阳性预测值(PPV)均为100%,阴性预测值(NPV)均为99.6%。分析5例确诊TM病例,发现优化后ELISA检测体系可比培养法提前2-10天出临床报告,提示该体系可作为TM感染实验室早期诊断的辅助手段。经临床标本评价,提示:优化后的混合单抗-单抗检测体系,与原有的多抗-单抗检测体系具有相似的灵敏度和特异性。但是ELISA体系的原料可用单克隆抗体替代多克隆抗体,简化流程,降低批次差异。结论:一、基于原有抗体,成功建立一套双抗体夹心(4株单抗混合包被,1株单抗作为检测抗体)体系,并对体系进行优化,为TM感染早期诊断提供依据;二、经不同来源的TM菌株、不同浓度、不同时间培养上清评价,与原有检测体系相比,优化后体系可检测不同菌株分泌的Mp1p,且更为灵敏,检测重组Mp1p灵敏度相同,与其他真菌培养上清无交叉反应;三、经临床病人血清评价,优化后的检测体系,与原有检测体系具有相似且性能较好的灵敏度和特异度,较培养法提前2-10天不等报告阳性,可用于临床TM感染的辅助诊断。