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目的:观察烧伤后骨骼肌细胞膜完整性变化,探索MG53在烧伤后骨骼肌膜修复障碍中的作用及其分子机制。方法:一、体内实验:按随机数字表将216只雄性健康BALB/C小鼠随机分为正常对照(C)组,烧伤对照(B)组,烧伤+胰岛素治疗(I)组。C组只给予麻醉和剃毛,37℃水9秒假烫伤;B、C组给予90℃水烫伤9秒,造成30%体表面积Ⅲ度烧伤。伤后各组均给予正常饮食及饮水,I组于烧伤后6h(麻醉清醒后)皮下注射甘精胰岛素(5UI/kg.d),B组于烧伤后6h皮下注射等体积生理盐水,C组皮下注射等体积生理盐水,每天1次。观察伤前及伤后2、5、10和14天各项指标的变化。(一)通过腹腔注射伊文思蓝(EBD),检测肌细胞内EBD荧光强度和EBD含量,反映肌膜完整性;(二)采用Treadmill实验和腹腔注射EBD,通过对比运动前后肌细胞内EBD荧光强度和EBD含量反映肌膜修复能力。采用机械分离和酶消化法,分离单条肌纤维。用紫外线破坏肌纤维膜,检测流入肌丝的FM1-43荧光强度以反映肌纤维膜的自我修复能力;(三)采用甘油-3-磷酸激酶氧化(GK-GPO)法,测定甘油三酯(TG)含量;(四)采用treadmill实验,检测小鼠小腿肌肉耐力;(五)采用还原性免疫印迹(WB)法检测骨骼肌中MG53、蛋白二硫键异构酶(PDI)、CCAAT/增强子结合蛋白(CHOP)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK-a)、p-AMPK-a、胰岛素受体底物1(IRS-1)与细胞因子信号抑制物(SOCS-1和SOCS-3)蛋白含量;采用非还原性免疫印迹法检测MG53蛋白多聚体含量。二、体外实验:体外培养小鼠骨骼肌前体细胞株C2C12,并诱导分化48h。(一)实验分为正常对照(Control)组,胰岛素(INS)组,胰岛素+PI3K抑制剂(ins+ly294002)组。分别采用多聚酶链式反应(pcr)和免疫印迹(wb)法检测mg53mrna和蛋白的表达量;(二)实验分为正常对照(control)组,腺苷酸激活蛋白激酶激动剂(aicar)组。分别采用多聚酶链式反应(pcr)和免疫印迹(wb)法检测mg53mrna和蛋白的表达量;(三)建立烧伤微环境模型,实验分为正常对照组(control)组,烧伤血清组(bs),烧伤血清+stat抑制剂(bs+s3i-201)组。采用免疫印迹(wb)法和免疫荧光(if)法检测c2c12细胞中irs-1、socs-1和socs-3蛋白表达的变化。结果:1.烧伤后骨骼肌膜完整性的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比,伤后第14天腓肠肌中ebd含量显著升高(p<0.05)。与烧伤对照组相比,胰岛素治疗组小鼠腓肠肌中ebd含量有所减少(p<0.05)。2.烧伤后骨骼肌膜自我修复功能的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比,烧伤对照组小鼠伤后第14天运动后腓肠肌中ebd明显增加(p<0.05)。与正常对照组相比,烧伤对照组小鼠伤后第14天肌纤维内fmi-43明显增加(p<0.05)。与烧伤对照组相比,胰岛素治疗组小鼠运动前后腓肠肌中ebd增量显著降低(p<0.05),肌纤维内fmi-43含量显著降低(p<0.05)。3.烧伤后骨骼肌重量,脂质沉积和耐力的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比,烧伤对照组小鼠伤后第5、10和14天小鼠腓肠肌重量明显降低(p<0.05),伤后10、14天腓肠肌中tg明显升高(p<0.05),伤后2、5、10和14天小腿肌耐力均明显降低(p<0.05);与烧伤对照组相比,胰岛素治疗组小鼠腓肠肌重量,tg含量有所降低(p<0.05),小腿肌耐力有所增加(p<0.05)。4.烧伤后骨骼肌中mg53表达和多聚化的变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比,烧伤组小鼠在伤后14天腓肠肌中mg53表达显著降低(p<0.05)。烧伤组小鼠伤后5、10和14天腓肠肌中mg53多聚体显著减少(p<0.05)。与烧伤对照组相比,胰岛素治疗组烧伤小鼠伤后14天腓肠肌中mg53表达明显升高(p<0.05),伤后5天腓肠肌mg53多聚体明显增加(p<0.05),而伤后10和14天mg53多聚体无明显变化(p>0.05)。5.烧伤后骨骼肌中内质网应激标签蛋白pdi、chop表达变化及胰岛素对其的影响。与正常对照组相比,烧伤组小鼠伤后5、10和14天腓肠肌中pdi表达显增加(p<0.05)。烧伤组小鼠伤后5、10和14天腓肠肌中chop显著增加(p<0.05)。与烧伤对照组相比,胰岛素治疗组小鼠腓肠肌中PDI和CHOP表达无明显差异(P>0.05)。6.胰岛素通过胰岛素信号通路促进MG53合成,AICAR对MG53合成无明显影响。与正常对照组相比,胰岛素可使C2C12中MG53 mRNA水平和蛋白表达明显升高(P<0.05)。与胰岛素组相比,胰岛素+PI3K抑制剂作用下,C2C12中MG53 mRNA水平和蛋白表达明显降低(P<0.05)。与正常对照组相比,AICAR组C2C12中MG53m RNA水平和蛋白表达无明显变化(P>0.05)。7.烧伤后骨骼肌AMPK-a、p-AMPK-a、IRS-1、SOCS-1和SOCS-3表达变化。与正常对照组相比,烧伤组小鼠腓肠肌中在烧伤后2-14天AMPK-a、p-AMPK-a表达均降低(P<0.05);烧伤组小鼠腓肠肌中在烧伤后2-14天IRS-1表达均降低(P<0.05);烧伤后2、5和10天腓肠肌中SOCS-1表达明显升高(P<0.05),SOCS-3在烧伤后10、14天显著升高(P<0.05)。8.烧伤后血清刺激下C2C12中SOCS-1、SOCS-3和IRS-1表达变化,及SOCS对IRS-1表达的影响。与正常对照组相比,在烧伤血清作用下C2C12中SOCS-1和SOCS-3表达明显升高,而IRS-1明显减低(P<0.05);与烧伤血清组相比,烧伤血清+抑制剂S3I-201组C2C12中SOCS-1和SOCS-3表达明显降低(P<0.05),而IRS-1表达明显升高(P<0.05)。结论:1.严重烧伤后肌膜自我修复功能障碍引起的肌膜破损是骨骼肌萎缩、无力和脂质沉积的重要原因。2.烧伤后骨骼肌中MG53表达缺陷和寡聚化异常是肌膜自我修复功能障碍的主要原因。3.烧伤后骨骼肌中SOCS激活引起的SOCS-1、SOCS-3表达升高可导致IRS-1降解,产生胰岛素抵抗,与伤后骨骼肌中MG53缺乏密切相关。4.烧伤后骨骼肌中内质网应激(ERS)引起PDI功能异常是导致MG53寡聚化障碍的重要原因。5.胰岛素治疗可适度提高烧伤后肌膜自我修复能力。