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钙离子作为植物细胞内的第二信使物质,介导细胞对外界刺激的反应应答,调控细胞内许多重要的生理和生化过程。大量研究表明,细胞对许多外界环境和激素等刺激作出的应答是通过胞质内游离钙离子浓度变化来传递的。因此,实时监测细胞内游离钙离子浓度的变化水平对于研究激素信号转导机制至关重要。 目前,商业化应用于胞质游离钙离子测定的荧光探针数目有限且存在光漂白等缺陷。量子点因其优异的性能如表面易功能化、激发光谱宽、抗光漂白等,使它成为性能优异的荧光探针。本文基于量子点的发光特性,通过偶联的方法将乙二醇双(乙二氨乙基醚)四乙酸(EGTA)修饰到巯基乙胺修饰的碲化镉量子点(CdTe/MAQDs)的表面,获得一种能特异性识别细胞钙离子的探针,对探针进行表征,并应用于拟南芥叶肉细胞中游离钙离子浓度变化的测定。 本论文的绪论概述了细胞内游离钙离子的检测方法,商业化的荧光探针的种类、特点和应用研究进展,介绍了基于功能基团不同的量子点的应用研究进展,重点介绍新型量子点荧光探针在分析测试中的应用研究。本文的主要工作和取得的主要成果如下: 1.以巯基乙胺为修饰剂,水相条件下制备荧光性能优越的CdTe量子点,考察了原料的摩尔比(Cd2+:HTe-:MA)、pH值、回流时间、回流温度与及体系的浓度对荧光强度的影响,采用透析的方法对量子点进行纯化;在优化的实验条件下,通过EDC作偶联剂的方法将钙离子螯合剂EGTA修饰到CdTe/MA量子点的表面制备CdTe/MA-EGTA;采用透射电镜、毛细管电泳、荧光显微镜、荧光光谱、荧光寿命、紫外-可见光谱及红外光谱等表征手段对CdTe/MA量子点与EGTA偶联前后进行了表征,证明已成功制备CdTe/MA-EGTA。 2.采用功能化的CdTe/MA-EGTA荧光探针对钙离子进行识别。在优化的实验条件下,CdTe/MA-EGTA荧光探针对钙离子有特异性响应,钙离子对CdTe/MA-EGTA的荧光强度有明显的猝灭作用,且钙离子浓度在0.0μmol·L-1~15.0μmol·L-1的范围内,荧光强度的猝灭与钙离子的浓度成良好的线性关系,线性回归方程为△F=1.1+3.6CCa2+(R=0.9961),方法的检出限为0.74μmol·L-1。基于钙离子对CdTe/MA-EGTA的猝灭作用建立量子点荧光探针特异性识别钙离子的新方法。 3.选用培养10天的拟南芥叶片,用钙离子荧光探针CdTe/MA-EGTA监测细胞内游离钙离子在茉莉酸刺激下的变化趋势。实验结果表明,在优化的实验条件下,用激光共聚焦显微镜以514nm激发,在561~604nm范围内观察,可以知道在茉莉酸的刺激下,胞内Ca2+浓度上升,探针荧光强度急剧猝灭。另外,与传统细胞钙荧光探针Fluo-3相比,Fluo-3在488nm光激发下,1min荧光猝灭率约为80%,CdTe/MA-EGTA探针的抗光漂白性能好,适合于长时间的跟踪和监测。 4.为避免植物自发荧光对绿色荧光探针应用的干扰,改变合成条件,制备了发红光的CdTe/MA-EGTA荧光探针。采用粒度分析、Zata电位分析、荧光光谱、荧光寿命、紫外-可见光谱及红外光谱等一系列表征手段对红光CdTe/MA量子点与EGTA偶联前后进行了表征,证明已成功制备发红光的CdTe/MA-EGTA。红光CdTe/MA-EGTA荧光探针对钙离子有特异性响应,且钙离子浓度在0.0μmol·L-1~35.0μmol·L-1的范围内,荧光强度的猝灭与钙离子的浓度成良好的线性关系,线性回归方程为△F=7.0+0.9CCa2+(R=0.9976),方法的检出限为2.3μmol·L-1。将制备的红光量子点荧光探针应用于绿豆下胚轴中的荧光显微细胞成像试验,可以克服植物自发荧光干扰。 本文创新点: 1.制备了一种新型的光谱可调谐的钙离子荧光探针CdTe/MA-EGTA,其中发红光探针能克服植物自发荧光背景。基于钙离子对此探针的特异性响应,探针荧光强度猝灭,建立了一种新的测定钙离子的新方法。 2.利用CdTe/MA-EGTA荧光探针,通过激光共聚焦显微镜,监测拟南芥叶细胞在植物激素茉莉酸刺激前后胞内游离钙离子浓度的变化,CdTe/MA-EGTA作为一种新型的细胞钙荧光探针其抗光漂白、灵敏度、检出限明显优于商品化的荧光探针Fluo-3/AM。