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淋病(gonorrhea)是由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,简称淋病奈瑟菌)引起的经典性病之一。人类是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主,主要通过性接触而传播。感染淋病奈瑟菌之后,患者发生泌尿生殖系统的损害,表现为尿道炎和宫颈炎,以及附睾炎、盆腔炎等并发症,女性患者还可由于并发症造成不育、宫外孕等严重后果。淋病常见,在世界范围内广为流行;据近年来世界卫生组织估计,全世界每年约有6200万新病例发生,其中以欧美和非洲一些国家尤甚。发病与病人因素,诸如年龄、性别、种族、受教育程度、性行为方式及免疫力有关,并随地区和季节的不同会有所变化。在美国,淋病发病率在男性中最高,而在妇女中带菌最高。美国通过实施淋病控制计划,已使淋病处于30年来最低水平,远低于非淋菌性尿道炎的发病率。我国解放前淋病流行十分严重,解放初期淋病占第三位。到二十世纪六十年代中期,淋病基本被消灭。八十年代淋病又重新传入我国,据16个城市监测,1987年淋病患者为11,115例,1997年发生淋病224,331例,1999年340,960例,年增长率超过30%,淋病发病率为20.63/10万,居性病之首。2000年之后开始下降,淋病患者为285661人,2001年为234,561人,居第二位。淋病奈瑟菌主要侵犯粘膜,尤其对单层柱状上皮和移行上皮细胞有很强的亲和力,淋病奈瑟菌侵入前尿道或子宫颈后,借助菌毛、外膜蛋白粘附到柱状上皮细胞表面进行繁殖,之后被柱状上皮细胞吞饮,进入细胞内大量繁殖,导致细胞损伤裂解。淋病奈瑟菌在逸入粘膜下层,通过内毒素与补体、IgM等协同作用,诱导中性粒细胞聚集吞噬,引起局部急性炎症,出现充血、水肿、粘膜糜烂和尿痛,形成典型尿道脓性分泌物。当细菌进入尿道腺体和隐窝后,腺管开口及隐窝被阻塞,潜藏的细菌可引起慢性淋病。近年研究发现,淋病奈瑟菌外膜蛋白在致病过程及宿主免疫反应中起着重要作用,其外膜蛋白至少有3种,分别称为外膜蛋白Ⅰ(PⅠ)、外膜蛋白Ⅱ(PⅡ)、和外膜蛋白Ⅲ(PⅢ),其中PⅠ占外膜蛋白的60%以上,在细胞膜上形成孔道,又称孔洞蛋白Porin(Por)。淋病奈瑟菌血清学分型主要有PⅠA和PⅠB,可使水溶性物质、对细菌代谢有重要作用的物质及某些抗生素通过细胞膜进入细胞内。PⅠ作为外膜中的主要成分,因其相对保守的基因序列及相对稳定的表达而受到越来越多的重视,已经证实纯化的PⅠ在真核细胞浆膜脂质双分子层中形成电压依赖式离子选择通道,这与淋病奈瑟菌的致病密切相关。PⅠA的粘附功能需要孔洞处于一个开放状态,从而提供电压依赖受体结合部位和/或有效的嵌入宿主上皮细胞表面发挥离子通道的功能。淋病奈瑟菌外膜中大部分的PⅠ以三聚体形式与PⅢ形成复合物。PⅢ暴露的表面随着PⅠ表型的变化而变化,因此可以怀疑在PⅠ介导的粘附过程中是否是PⅢ起了实际作用,vanPutten等利用基因敲除(knockout)方法证实,在无PⅢ的情况下真正起粘附作用的仍然是PⅠA。淋病奈瑟菌的致病机制复杂,粘附是其致病的先决条件。淋病奈瑟菌入机体后首先需粘附于泌尿生殖道上皮细胞表面,然后才能进入机体引起一系列病变。以往只认为菌毛是该菌的粘附结构,但近年研究发现,外膜蛋白在致病菌粘附过程中也是至关重要。鉴于该菌的结构特点及致病特点,本研究选用淋病奈瑟菌PⅠA基因作为靶基因,构建淋病奈瑟菌真核表达载体(pCI-PⅠA),观察pCI-PⅠA的PⅠA在小鼠肌细胞浆和膜上的表达,研究其在动物体内中所诱导的免疫反应,观察免疫产物体外抗菌效果。本研究工作分以下二个部分:一、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI-PⅠA的构建、鉴定和体内表达1、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI-PⅠA的构建、鉴定常规酚-氯仿法提取淋病奈瑟菌捷克标准株基因组DNA,根据淋病奈瑟菌外膜蛋白PⅠA基因序列设计一对携带限制性核酸内切酶(EcoR I,Sal I)位点的引物,采用PCR方法获得PⅠA全基因片段,产物经酚:氯仿:异戊醇抽提后以乙醇沉淀纯化;纯化产物和载体质粒pCI-neo分别经EcoR I,Sal I酶切后行凝胶电泳回收目的片段和质粒大片段,经T4连接酶连接;连接产物转化到感受态细胞中,经氨苄青霉素抗性、双酶切和测序筛选出阳性克隆,命名为pCI-PⅠA。2、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI- PⅠA体内表达6只Balb/c小鼠分成3组,每组2只,分别注射pCI-PⅠA、空白质粒pCI-neo和生理盐水,100ug/35ul/只,初次免疫后10天同剂量行加强免疫一次。末次免疫4天后处死小鼠,取双侧股四头肌作石蜡切片。采用免疫组化方法检测pCI-PⅠA在小鼠骨骼肌细胞中的表达。结果发现,pCI-PⅠA在小鼠骨骼肌细胞膜和细胞浆中均获得PⅠA的表达,表明淋病奈瑟菌主要外膜蛋白(PⅠA)真核表达载体pCI-PⅠA在动物体内表达成功。二、淋病奈瑟菌真核表达载体pCI- PⅠA接种、免疫效果的观察1、pCI- PⅠA的接种30只Balb/c小鼠随机分成3组,每组10只,分别注射pCI-PⅠA(100ug/35ul/只)、空白质粒pCI-neo(100ug/35ul/只)和生理盐水(35ul/只),初次免疫后第3周和第6周各加强免疫一次。分别于第0周(免疫前)、第3、6、8、10、12、16、18周,自小鼠尾静脉取血,100ul/只,收集血清,第22周自眼眶取血收集血清。采用ELISA方法动态分析小鼠免疫前后血清特异性IgG抗体水平的变化,以及体外溶菌试验观察免疫血清杀菌效果。结果显示,血清特异性IgG抗体随着免疫时间的延长,效价逐渐升高,至第10周达到最高值(1:4000),维持到第12周后开始逐渐下降,至第18周降低到最低水平。2、抗PⅠA抗体体外杀菌效果的观察取2张玻片,各滴加免疫血清和生理盐水,其中生理盐水为对照组,分别加入活的淋病奈瑟菌,数分钟后观察有无凝集,37℃15min孵育后,继续加入新鲜正常小鼠血清(含补体),再孵育30min,反应体系倒入巧克力固体培养基上进行培养,24 ~ 48小时后观察结果。与阴性对照比较,菌落数减少25%即定为杀菌效力为“+”;菌落数减少25～50%即定为杀菌效力为“++”;菌落数减少50～75%即定为杀菌效力为“+++”;菌落数减少75～100%即定为杀菌效力为“++++”;菌落数减少50%以上为明显杀菌,即该血清对该淋病奈瑟菌临床株具有显著的杀菌作用。3、T淋巴细胞增殖反应18只Balb/c小鼠随机平均分成3组,分别注射pCI-PⅠA(100ug/35ul/只)、空白质粒pCI-neo(100ug/35ul/只)和生理盐水(35ul/只),每周免疫1次,连续3周,末次免疫7天后,处死小鼠,取脾制备T淋巴细胞悬液,调整细胞浓度为2×106/ml,取100ul细胞悬液于96孔板中,实验孔加入10 ug纯化PⅠA蛋白,对照孔不加PⅠA蛋白,温箱孵育72小时后,加入MTT,孵育4小时后加入二甲桠砜,测OD570值,实验孔OD570值与对照孔OD570值差值代表淋巴细胞增殖能力。实验证实pCI-PⅠA免疫组小鼠淋巴细胞在体外受到PⅠA蛋白再次刺激后出现的明显的增殖,与空白质粒pCI-neo对照组相比有显著性差异(P<0.01),表明pCI- PⅠA能诱导机体T淋巴细胞的特异性反应。结论:淋病奈瑟菌主要外膜蛋白抗原(PⅠA)的真核表达载体免疫保护作用在国内未见报导。本研究用分子生物学技术成功构建淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PⅠA真核表达载体pCI-PⅠA;后者免疫Balb/c小鼠后能产生血清证实有特异性抗体,抗体在体外有一定杀菌作用;T淋巴细胞增殖实验证实pCI-PⅠA能诱导特异性的细胞免疫反应。由于目前蛋白疫苗制备纯化困难,成本较高,且需重复接种才能达到较好的免疫效果等问题的存在,本研究工作为防治淋病提供了一种新的候选疫苗。