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绒毛膜癌是一种高度恶性滋养细胞肿瘤，起源于培养滋养层，可能发生于流产之后，或异位妊娠过程中。绒癌可通过静脉和淋巴系统广泛地转移到其他器官或组织中。早期血液和淋巴结转移可导致患者迅速死亡。近年来转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)成为肿瘤研究的热点因子之一，并且它在绒癌的发生和发展中是一个关键因素。转化生长因子β（TGFβ）是一种具有多生物学活性功能的多肽类细胞因子，TGFβ至少有5种异构体（TGF-β1～5），其中TGF-β1是主要存在形式，几乎所有的细胞都能分泌TGF-β1。它可以调节细胞增殖、分化、促进细胞外基质(ECM)形成，参与胚胎发育调节等，并且其与肿瘤的发生发展密切相关。TGFβ/Smads信号转导通路主要由细胞膜表面的TGFβ受体及其下游胞质内Smad蛋白家族组成。TGFβ首先识别并与细胞膜表面的受体结合，受体复合物再激活其下游的蛋白smad2、3，使其磷酸化。被激活的smad2、3与Smad4结合，形成复合物，然后进入细胞核与核内的各类转录因子结合，调控靶基因的转录。近年来p38丝裂素活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）在肿瘤的侵袭转移的研究中也成为热点之一，并且有报道显示TGFβ可激活p38MAPK通路，在胃癌和大鼠心肌成纤维细胞中两个通路有交互作用，但在绒毛膜癌中TGFβ与p38MAPK通路相互作用的关键位点及其机制尚不明确，因此本实验拟应用TGF-β1受体阻滞剂及p38MAPK抑制因子对被TGF-β1刺激活化的绒癌JEG-3细胞进行干预，对两条通路的下游蛋白进行检测以揭示两条信号通路在绒毛膜癌中交互作用的位点和作用机制。目的：探讨TGF-β1介导的Smad3与p38MAPK在绒癌JEG-3细胞中的串话作用。方法：1.人绒癌细胞系JEG-3生长在含10%的胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L丙酮酸钠，100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每2-3d换液一次。当细胞长至70-80%左右时用0.02%EDTA和0.25%胰酶消化液按1:3的比例进行传代。2.JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于24孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分为空白对照组，2h TGF-β1刺激组，6h TGF-β1刺激组。培养终止前2h和6h分别给予不同组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。每组设置3个复孔，用免疫荧光染色法对P-Smad的表达及核转位情况进行检测。3. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分别为：空白对照组，TGF-β1刺激组，p38抑制剂（SB203580）1μM组，p38抑制剂（SB203580）3μM组， TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制剂（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用免疫印迹法检测各组细胞中Smad3以及P-Smad3的蛋白表达水平。4. JEG-3细胞以初始浓度为5×104个/mL接种于6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中培养，次日换以无血清的RPMI-1640饥饿培养12h。将细胞分组设置为6个组，分组情况如上所述。培养终止前4h分别给予各抑制剂组细胞相应浓度的TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）及p38抑制因子（SB203580）。在终止培养前2h，给予各组细胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白对照组除外。用实时定量PCR法检测smad3的mRNA表达水平。结果：1.在对照组中，P-Smad的表达成云雾状主要呈现在胞浆中，少量表达在细胞核。TGF-β1给予2h后，P-Smad3呈现胞浆胞核均表达。在TGF-β1给予6h后，P-Smad3主要表达在胞核，即TGF-β1给予6h，P-Smad3基本完成了由胞浆到胞核的核转位过程。2．与空白对照组相比，TGF-β1刺激组的Smad3，P-Smad3蛋白表达增高(P<0.05)，而TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）1μM组，TGF-β1受体阻滞剂（LY364947）3μM组中随TGF-β1受体阻滞剂浓度的升高，Smad3，P-Smad3的蛋白表达呈浓度依赖性降低(P<0.05)。与TGF-β1刺激组相比，p38抑制剂（SB203580）1μM组，p38抑制剂（SB203580）3μM组中随着抑制因子浓度的升高，Smad3，P-Smad3蛋白的表达亦呈浓度依赖性降低(P<0.05)。3.与对照组相比，TGF-β1刺激组中的Smad3的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与其TGF-β1刺激组相比，随着抑制剂浓度的升高，TGF-β1受体阻滞剂组和p38抑制剂组中Smad3的转录表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论：1. TGF-β1可激活Smad3，并促使磷酸化的Smad3进行核转位。2.阻滞了P38MAPK通路，TGFβ介导的Smad3，P-Smad3蛋白表达均降低，且成浓度依赖性。3.阻滞了P38MAPK通路，TGF-β1介导的Smad3的转录水平降低，且成浓度依赖性。