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红曲菌在中国有着上千年的应用历史,它具有产生多种聚酮类次生代谢物的能力,如Monacolin K、红曲色素以及桔霉素等。从重要次生代谢产物生物合成基因入手进行研究,揭示这些重要化合物的生物合成途径,对更好地开发红曲菌中蕴藏的丰富资源有着重要意义。本文根据已报道的聚酮合酶基因(PKS)同源探针,加以修改,合成了一系列的简并引物,以红色红曲菌(Monascus ruber)基因组DNA为模板,采用PCR方法制备同源探针。利用制备的探针,从随后构建的红色红曲菌基因组cosmid文库中克隆到一个PKS基因,将其命名为mrpks1,并对其进行了初步的结构分析和功能预测。同时构建了一个用于同源双交换策略进行基因破坏的质粒,并将该质粒转入根瘤农杆菌中,为下一步的体内基因功能研究奠定了基础。
本文同时还对如何利用基因工程手段进一步提高工业生产中头孢菌素C的产量进行了初步的研究,对CPC生物合成途径中潜在的改造位点进行了分析。认为减少生产中CPC在胞外的水解可能是一个新的切入点。根据已报道的头孢菌素C乙酰水解酶的编码基因cahB为模板设计了引物,以本实验室保存的顶头孢霉(CGMCC3.3795)的基因组DNA为模饭进行PCR扩增,得到全长1.4 kb的DNA片段,经测序比对,发现与报道的cahB基因100%一致。该工作为在体内对cahB基因进行敲除奠定了基础。