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[目 的]1.用不同浓度梯度的基质细胞衍生因子(stromal cell derived factor-1,SDF-1)预处理SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stromal cells,BMSCs),探讨在一定浓度范围内SDF-1对BMSCs的迁移及增殖能力的影响,得到最佳预处理浓度,指导体内实验。2.利用SD大鼠为实验动物,改良后建立类似于临床慢性肾病的动物模型。3.经SDF-1预处理的BMSCs经肾动脉途径移植入慢性阿霉素肾病大鼠体内,检测移植后大鼠的各项肾功能指标、肾组织病理改善及肾脏中BMSCs的分布,从而验证SDF-1在体内促进BMSCs迁移及修复肾实质细胞的作用。4.探讨SDF-1介导BMSCs迁移至受损肾脏,提高BMSCs修复能力的机制。[方法]1.分离、提纯、鉴定、标记BMSCs取100g-130g健康雄性SD大鼠股骨、胫骨,冲洗骨髓腔,采用贴壁培养法分离获得BMSCs,流式技术鉴定细胞表型,绿色荧光蛋白转染标记细胞。2.研究SDF-1预处理BMSCs对其迁移能力和增殖活性的影响根据SDF1浓度将实验分为5组:SDF-1 0ng/ml(对照组);SDF-1 10ng/ml;SDF-1 50ng/ml;SDF-1 100ng/ml;SDF-1 200ng/ml。采用 Transwell 趋化实验,研究SDF-1对BMSCs迁移作用的影响。应用MTT法,全自动酶标仪测定各组吸光度值,绘制细胞生长曲线,探索SDF-1对BMSCs增殖活性的影响。选择最佳的SDF-1预处理浓度,体外与BMSCs共培养6小时进行,备用。并鉴定SDF-1预处理后BMSCs成骨、成脂能力。3.检测BMSCs移植治疗2周后大鼠肾功能、肾脏病理改变采用雄性(体质量为300g-350g)清洁级SD大鼠,分2次尾静脉注射阿霉素制备慢性肾病模型,末次注射药物后第4周末,随机选择60只分为3组(模型组、BMSC组、SDF-1/BMSC组)。BMSC组:注射未经SDF-1预处理的BMSCs;SDF-1/BMSC组:注射经SDF-1预处理的BMSCs;模型组:不输注BMCSs,仅在其他组输注BMSCs时输注等量培养基。三组均通过肾动脉介入途径输注细胞悬液2ml,细胞数为2×106个。同时随机选择同批次健康大鼠20只作为对照组,同样在其他组输注BMSCs时经肾动脉途径输注等量培养基。分别于末次注射当天、末次注射后2周检测大鼠血液中尿素氮、肌酐、血清总蛋白及24h尿蛋白。HE染色观察肾脏病理,荧光显微镜观察绿色荧光在肾脏的分布。ELISA法测血清中部分细胞因子(VEGF、IL-1β、TNF-α、TGF-β)表达量。[结 果]1.BMSCs的分离纯化与鉴定:大鼠BMSCs传到P4代时,细胞大小形态较为均一,呈长梭形。细胞表面抗原CD45、CD11b的阳性率为2.2%、1.9%,CD29、CD44的阳性率高达97.1%和97.9%。绿色荧光蛋白转染率为85%。2.SDF-1对BMSCs迁移能力和增殖活性的影响:Transwell体外趋化实验结果:与对照组(0ng/ml)相比,各实验浓度的sdf-1(10 ng/mL、50ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL)趋化的细胞数目均显著增加(P<0.05)。当 SDF-1 在 10～100 ng/mL 范围时,SDF-1 对 BMSC 的趋化作用呈剂量依赖性,其中以SDF1为100 ng/mL时,趋化的细胞数最多,与10 ng/mL组、50ng/mL组相比,差异均显著(P<0.05)。而当浓度继续增加至200ng/ml时,相比100 ng/mL组,趋化的细胞数增加不明显。MTT实验结果显示,SDF-1 10 ng/mL组、SDF-1 50 ng/mL组、SDF-1 100 ng/mL 组、SDF-1 200 ng/mL 组,OD 值明显高于对照组(P<0.05);且 SDF-1 10 ng/mL组、SDF-1 50 ng/mL组、SDF-1 100 ng/mL组,各浓度组之间均有统计学差异,SDF-1呈浓度依赖性促进BMSCs细胞增殖(P<0.05)。而SDF-1 100 ng/mL组与SDF-1 200 ng/mL之间,OD值无显著差别(P>0.05)。实验结论与Transwell实验结果一致。SDF-1与BMSCs共培养进行预处理后,经成骨、成脂液诱导分化染色后可见BMSCs内脂滴和钙结节,说明SDF-1不会影响BMSCs成骨、成脂能力。3.肾功能改变:移植当天,SDF-1/BMSC组、BMSC组、模型组与对照组比较,肌酐水平明显升高(P<0.05),血尿素氮水平差异不明显(P>0.05)。在移植治疗2周后,与模型组相比,SDF-1/BMSC组、BMSC组的Scr、BUN、24小时尿蛋白排泄水平显著降低(P<0.05),ALB明显增加(P<0.05)。且与BMSCs组相比,SDF-1/BMSC组的Scr、24小时尿蛋白减少更明显,白蛋白增加量也更明显(P<0.05)。4.干细胞移植后肾脏病理结果:移植治疗2周后,光镜下:模型组肾小球系膜区增宽,呈局灶节段性硬化,球囊黏连,肾小管进行性扩张、管间可见蛋白管型,间质炎症细胞浸润,并有轻度纤维化。BMSC组肾小球系膜细胞不同程度增生,部分球囊粘连,小管间蛋白管型减少,局灶状炎性细胞浸润。BMSC/SDF-1组的系膜区可见少量细胞增生,大部分毛细血管襻扩张,肾小管无明显扩张,肾间质炎症细胞浸润少,纤维化不明显。5.移植的BMSCs在各组肾组织中的分布干细胞移植治疗2周后,荧光显微镜下可见模型组和对照组几乎没有绿色荧光分布;BMSC组肾小管处可见分布,肾小球系膜区有少量,BMSC/SDF-1组绿色荧光不仅在肾小管处,在肾小球内也可见大量分布。6.BMSCs移植2周后血清部分细胞因子表达在BMSCs移植治疗2周后,与模型组比较,BMSC组及SDF-1/BMSC组血管表皮生长因子(VEGF)表达均显著上升(P<0.05),且SDF-1/BMSC组上升水平高于BMSC组(P<0.05);BMSCs组大鼠血清TNF-α水平下降(P<0.05),而IL-1β,TGF-β表达水平无明显变化(P>0.05);而SDF-1/BMSC组IL-1β,TNF-α、TGF-β1水平均明显下降(均P<0.05),且TNF-α降低水平较BMSCs组更为显著(P<0.05)。[结论]1.在体外,SDF-1可增强大鼠BMSCs的迁移能力及增殖活性,且在一定范围内迁移的细胞数量呈SDF-1浓度依赖性,其中以SDF-1 10Ong/mL浓度干预下,BMSCs具有最强趋化效应和增殖活性,可指导体内实验。2.在慢性阿霉素肾病大鼠体内,肾动脉介入途径输注经SDF-1 100ng/mL浓度预处理的BMSCs可以显著增加细胞靶向归巢至受损肾脏的细胞数及存活率,与体外实验结论一致。3.SDF-1预处理可促进细胞旁分泌作用。具体表现为抑制巨噬细胞积聚,减轻外基质沉积,增加新生血管形成,减缓纤维化,改善肾功能。